嗜黏蛋白阿克曼菌在硫乙醇酸盐液体培养基中的生长情况与代谢产物（一）
嗜黏蛋白阿克曼菌（Akkermansia muciniphila，Akk）被称作新一代益生菌，是一种典型的哺乳动物肠道菌，依赖于肠道上皮细胞分泌的黏蛋白生存，是肠道黏液层的关键微生物，更与多种疾病存在重要关联。Akk作为一种典型的肠道菌，只能耐受低浓度的氧气，其体外培养更是生长周期长、生长速度慢。本团队研究发现，Akk可利用硫乙醇酸盐液体培养基，且该培养基成分简单价格便宜，唯其生长速度较为缓慢。
东北农业大学食品学院,乳品科学教育部重点实验室的武晓玲、徐珒昭、许晓曦*等人利用非靶向代谢组学技术对比分析Akk在硫乙醇酸盐液体培养基和优化培养基中代谢产物的差异，结合京都基因与基因组百科全书（KEGG）通路探究其特征性代谢产物与疾病的关联，并以此证明优化培养基在工业化高密度培养中的优势及应用前景，旨在为Akk在中国的工业化生产提供科学基础。
1 Akk在两种培养基中的生长情况对比
由于Akk在硫乙醇酸盐液体培养基中生长其菌液密度极低（生长速度慢且活菌数较少），因此本课题组前期在硫乙醇酸盐液体培养基的基础上，对Akk培养基进行优化。为确定Akk在两种培养基中的生长稳定期以制备发酵上清液样本，并对比Akk在两种培养基中的生长情况，通过测定菌液OD600 nm并绘制生长曲线，结果如图1所示。
由图1可知，0～8 h为Akk的生长迟缓期，12 h左右进入生长对数期。在硫乙醇酸盐液体培养基中，Akk生长对数期为12～32 h，32 h菌液OD600 nm达到最高（0.269±0.003），之后进入稳定期，稳定期活菌数为6.75×107 CFU/mL。而在优化培养基中的生长对数期同样在12 h左右进入对数期，44 h时菌液OD600 nm最高可达0.761±0.011，是硫乙醇酸盐液体培养基的2.83倍，并在44 h之后趋于稳定，稳定期的活菌数为1.74×109 CFU/mL，比硫乙醇酸盐液体培养基高出2个数量级。由此可知，优化后的培养基虽相对延长了Akk的对数生长期，但显著提高了Akk的菌液密度及活菌数。并由此选择其在硫乙醇酸盐液体培养基和优化培养基中进入生长旺盛期的32 h和44 h发酵上清液，用以分析两组样本的差异代谢物。
2差异性代谢组学分析结果
2.1 QC分析
为评价仪器的稳定性及数据质量的可靠性，分别在正负离子模式下将QC样本总离子流图进行谱图重叠比较，结果如图2所示。结果表明两种模式下各色谱峰的响应强度和保留时间均基本重叠，说明在整个实验过程中仪器误差引起的变异较小，实验结果较为可靠。
2.2代谢物鉴定数量及化学分类归属统计
通过高效液相色谱-串联飞行时间质谱联用仪检测Akk在两种培养基发酵上清液中的代谢产物，正负离子模式下合计鉴定到代谢产物2 253种，其中正离子模式下鉴定到代谢产物1 585种，负离子模式下鉴定到668种。根据化学分类归属信息将所有代谢物进行分类统计，各类代谢物数量所占比例如图3所示。
两组样本中检测到的代谢物包括有机酸及其衍生物（34.976%），脂质和脂质类分子（21.127%），有机杂环化合物（10.567%），苯甲酸类（6.569%），有机氧化合物（5.237%），苯丙烷和聚酮（4.172%），核苷、核苷酸和类似物（2.308%），有机氮化合物（1.243%），生物碱及其衍生物（0.666%），木质素、新木质素及相关化合物（0.178%），有机金属化合物（0.133%），有机硫化合物（0.133%），烃类衍生物（0.089%）和未命名化合物（12.605%）等。
2.3组间差异分析
本研究结合单变量统计分析和多维统计分析方法，筛选Akk在两种培养基中的显著性差异代谢物，对正、负离子模式下检测到的显著性差异代谢物进行分析。
单变量统计分析
在进行两组样本间的差异分析时，常用的单变量统计分析方法包括差异倍数（FC）分析、T检验/非参检验。基于单变量分析，对正、负离子模式下检测到的所有代谢物（含未被鉴定的代谢物）进行差异分析，筛选出FC＞1.5或FC＜0.67，P＜0.05的差异代谢物共902种，其中正离子模式下670种，负离子模式下232种。将这些差异代谢物用火山图的形式表示，结果如图4所示。
如图4所示，每个圆圈代表一个特定的代谢产物，优化后相对优化前，红色为显著上调的代谢产物（FC＞1.5，P＜0.05），蓝色为显著下调的代谢产物（FC＜0.67，P＜0.05），圆圈越靠近左右两边和上边，差异性越显著，黑色为非显著性差异代谢物。之后研究均针对红色和蓝色圆圈代表的显著性差异代谢物。
多维统计分析
多维统计分析可以从总体水平反映组间差异以及组内的变异度，常采用的方法包括PCA和OPLS-DA。将鉴定到的所有代谢物重新线性组合得到PCA模型，采用PCA方法，能从总体上反映样本的总体分布趋势和组件样本的差异度。两组样本的PCA得分图如图5所示。
图5中椭圆代表95%置信区间，同一颜色的点表示组内的各个生物学重复，由点的分布状态可以看出，该模型可以区分两组样本，组间样本的数据点很好地集中在一起。PCA模型参数R2X越接近1表明模型越可靠，正、负离子模式下的模型解释率R2X分别为0.835和0.855。结果表明该模型稳定可靠，实验重复性好，随机误差较小，可进一步对样本进行差异性分析。
OPLS-DA得分图及OPLS-DA置换检验如图6所示，t能最大程度反映组间差异，而to则反映组内变异。可以看出OPLS-DA模型可显著区分两组样本，且组内差异较小，结果与PCA模型一致。经7次循环交互验证得到模型评价参数R2Y、Q2，通常情况下Q2＞0.5即表明模型稳定可靠。该模型正、负离子模式下的Q2分别为0.998、0.999，均大于0.5。在置换检验中，随着置换保留度逐渐下降，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，说明原模型不存在过拟合现象，模型稳定性良好。
筛选差异代谢物
OPLS-DA模型得到的变量权重值（VIP）表示变量投影重要度，值越大，表示越重要。本实验以VIP＞1和P＜0.05为显著性差异代谢物的筛选标准，正离子模式下筛选到670种显著性差异代谢物，负离子模式下筛选到232种显著性差异代谢物，由于筛选到的差异代谢物过多，且表格无法直观地显示这些代谢物的FC，因此，选择VIP值前50的差异代谢物，以柱状图形式展示鉴定到的显著性差异代谢物的FC变化，结果如图7所示。可以看出，与硫乙醇酸盐液体培养基相比，Akk在优化培养基中发酵后，正离子模式下22种代谢产物显著上调，28种代谢产物显著下调，负离子模式下显著上调代谢产物22种，显著下调代谢产物28种。后续将对这些显著性差异代谢产物进行分析。
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