嗜黏蛋白阿克曼菌在硫乙醇酸盐液体培养基中的生长情况与代谢产物（二）
2.4聚类分析
为了更全面直观地显示样本之间的关系以及代谢物在不同样本中的表达模式差异，将VIP值前50的显著性差异代谢物用层次聚类进行聚类分析，结果如图8所示。聚在同一簇内的代谢物具有相似的表达模式，可能具有相似的功能或者共同参与同一代谢过程或者细胞通路。
Akk发酵优化培养基产生的代谢产物中，显著上调的代谢产物有肌酸、2-哌啶酮、2-氨基-1-苯乙醇、乙酰磷酸酯、烟曲霉素、巴多昔芬、N-乙酰-L-蛋氨酸、柠檬酸盐、甘露糖和各种多肽等，这些代谢产物在人体疾病的调控中发挥着重要作用。文献结果表明，Akk的这些代谢产物是该菌在缓解肠道炎症，治疗癌症、神经系统等疾病主要功能因素。
显著下调的产物有：乌头碱、苯甲酰乌头原碱、烟酰胺、高三尖杉酯碱、灵芝酸、尿苷、焦谷氨酸、海藻糖、龙胆苦苷等。其中，乌头碱是有毒植物中存在的一种毒性成分—二萜类生物碱，毒性极强，具有心脏毒性、神经毒性、生殖毒性、胚胎毒性，同时能通过血液吸收危害肝脏、肾脏等靶器官。实验结果发现优化培养基中的乌头碱显著下调，说明Akk在优化培养基中发酵能更大程度发挥预防及治疗心血管疾病、神经系统疾病、肝脏疾病的作用。除此之外的Akk代谢产物均被发现有一定抗炎、抗肿瘤、抗肥胖等益生功效，但是优化培养基中这些产物均有不同程度的下调，因此表明，补充Akk活菌制剂时应注意其有效菌数，过多的活菌数可能带来疾病风险。也有研究提出，补充灭活Akk可显著改善超重/肥胖的胰岛素抵抗者的多项代谢指标，且安全性良好，效果优于Akk活菌，由此为其作为后生元提供了有效证据。
2.5 KEGG通路注释与分析
在生物体内不同代谢物需要相互协调行使其生物学功能，基于KEGG通路分析有助于更进一步了解其生物学功能。为了解Akk在不同培养基中代谢产物含量变化的机制，将正负离子模式下检测到的显著性差异代谢物整合后进行KEGG通路注释，并根据P值选择显著性最高的前20条KEGG通路进行富集，富集结果以气泡图的形式显示，结果如图9所示。
富集最显著的5个通路为蛋白质的消化和吸收、氨酰基tRNA生物合成、胆汁分泌、ABC转运蛋白、氨基酸生物合成。其中，蛋白质的消化和吸收通路富集最为显著，强调蛋白质是Akk的第一营养需求，因此培养基优化主要针对这一需求进行。在这些通路中，蛋白质的消化和吸收、胆汁的分泌是Akk消化系统中的代谢通路，氨酰基tRNA生物合成在Akk的遗传信息处理中发挥重要作用，ABC转运蛋白涉及到Akk的膜运输功能，对外界环境的信息进行处理，氨基酸生物合成则可合成多种氨基酸。除胆汁分泌通路外，其余4种代谢通路均富集到了多种氨基酸，人体所需的多种必需氨基酸包含其中，这些氨基酸均由培养基中的氮源即卵清蛋白和酪蛋白胨代谢得到。
富集到胆汁分泌通路上的代谢物有20种，这些代谢物包括茚地那韦、依托泊苷、普伐他汀、多西紫杉醇、阿昔洛韦、乌本苷、长春花碱等，其中茚地那韦是一种选择性、强效和特异性的HIV蛋白酶抑制剂，目前用于治疗获得性免疫缺陷综合征，还能显著减轻链脲佐菌素诱导的阿尔兹海默症（AD）相关的记忆缺陷，而相关研究表明，AD大鼠模型中，Akk可减轻AD大鼠的认知障碍。依托泊苷、多烯紫杉醇、长春花碱等均为有效的抗肿瘤和抗癌药物，可应用于相应的癌症治疗。此外一些研究也证实了Akk在肺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌等的治疗中发挥了重要作用。
因此表明，其胆汁分泌通路可能是Akk发挥其功效的重要通路之一。蛋白质的消化和吸收通路中富集到了一种短链脂肪酸——丙酸，它除能维持肠道健康、缓解肠道炎症外，在人体其他组织和器官中也可发挥重要作用，膳食中补充丙酸可通过抑制食欲提高胰岛素敏感性，并增加能量消耗防止高脂饮食引起的肥胖。据报道，Akk在体外培养时主要代谢产物为丁酸和丙酸，而在优化培养基发酵后丙酸呈现显著上调，一方面说明该培养基更有利于Akk发挥改善肠道疾病、减肥等作用。但目前也有报道，机体内有机酸累积与类风湿性关节炎有关。由此也表明，肠道中Akk活菌数量应保持一定上限，否则会带来不良健康影响。
Akk发酵优化培养基通过影响其代谢通路，这些代谢通路产生代谢产物较硫乙醇酸盐液体培养基显著上调，一方面表明该培养基组分能使Akk更好地发挥抗肿瘤、调节机体免疫、缓解肠道炎症等益生功能，另一方面，显著下调的代谢产物则从侧面说明如果肠道内Akk丰度过高可能带来某些疾病风险，如增加骨关节炎及类风湿性关节炎等患病风险等，且如果人体本身患有肠道炎症补充Akk活菌反而会加重病情。
结论
目前已知Akk与人体某些疾病存在重要关联，但至今为止将其工业化高密度培养依然存在技术难题。本研究对硫乙醇酸盐培养基进行了优化，筛选出了适合工业化生产的培养基配方，并通过非靶向代谢组学技术比较分析了Akk发酵优化培养基和硫乙醇酸盐液体培养基产生的代谢产物之间的差异，这些代谢产物与Akk发挥抗炎、抗癌、调节肠-脑轴和肠-肝轴等功能密切相关；将这些差异性代谢物进行KEGG通路富集，发现Akk的蛋白质消化和吸收通路富集最为显著，证明了影响该菌生长的最重要因素是蛋白质，同时也表明以此对培养基进行优化的合理性。为该培养基在工业化生产中应用提供了依据，也为将来Akk高密度培养以及作为后生元的可能性提供了研究和应用基础。
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