丙酸铵&中链脂肪酸可抑制饲料腐败真菌谢瓦列曲霉生长
研究背景：在饲料中添加防腐剂丙酸铵和中链脂肪酸（MCFA）对耐干燥真菌谢瓦列曲霉（Aspergillus chevalieri）的协同抗真菌效果。谢瓦列曲霉是一种常见的饲料腐败真菌，能在低水分活性条件下生长，导致饲料营养价值下降，并可能产生有害的次级代谢产物，如霉菌毒素，影响动物健康和产品安全。丙酸作为一种广泛使用的有机酸防腐剂，在低水分环境中能有效抑制多种腐败细菌、酵母和丝状真菌的生长，包括产毒的曲霉菌。然而工业应用中为了安全和便利，常将丙酸与氨水合用形成丙酸铵，这一过程虽然减轻了丙酸的刺激性，但也降低了其抗真菌效力。为弥补这一不足，研究者探索了添加MCFA以增强丙酸铵的抗真菌效果。MCFA是一系列饱和的脂肪酸，包括辛酸（C8:0）、癸酸（C10:0）和月桂酸（C12:0），它们因其亲脂性质而具有抗菌性，可能通过影响细胞膜或干扰能量产生过程中的膜定位过程来发挥作用。本研究中，通过实验方法研究者评估了丙酸铵和MCFA单独以及组合使用对谢瓦列曲霉休眠和发芽分生孢子、芽管和菌丝的影响。研究发现丙酸铵和MCFA的组合处理对谢瓦列曲霉的休眠分生孢子具有显著的协同抗真菌效果，几乎完全抑制了菌落的形成。此外该组合处理还显著降低了发芽率，并在对菌丝的短暂处理中增加了细胞死亡。显微镜观察显示，组合处理导致细胞结构出现扭曲和损伤，包括线粒体形态的异常变化，表明可能发生了自噬。本研究的发现对于提高饲料和食品储存的安全性和稳定性具有重要意义，为开发新的或改进现有的抗真菌剂提供了科学依据。通过使用丙酸铵和MCFA的组合，可能更有效地控制饲料中的真菌生长，减少经济损失，并提高动物产品的质量。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
oCelloScope微生物动态监测系统被用来监测和量化谢瓦列曲霉分生孢子的肿胀和随后的发芽过程。同时也可实时捕捉到分生孢子在不同处理条件下的变化，包括细胞的膨胀和发芽管的形成。该设备能获取96孔平底微量滴定板中沉降细胞的，使研究人员能够在一项实验中监测多种处理对分生孢子肿胀和芽管形成的影响。将分生孢子以105个分生孢子/ml的密度悬浮在麦芽提取物培养基中，并且对所有处理进行六倍测试。对于每次测量，每孔使用100μl的104个分生孢子，并且作为对照，监测对照麦芽提取物培养基中的分生孢子。用于采集图像、对象跟踪（包括分割）、对象计数和生长动力学分析。对于采集，选择24次重复，每孔2小时时间间隔，每个时间点从每个孔的中心拍摄10个图像。对于分割使用fungHmin算法（对比度=0.40，阈值=25.00），对于生长动力学分析，使用SESAfungiNormalized算法，用于计算增长率（特定增长率）的最大斜率。
实验结论
研究发现丙酸铵和中链脂肪酸（MCFA）的组合对谢瓦列曲霉（Aspergillus chevalieri）的休眠分生孢子、发芽分生孢子、芽管和菌丝具有显著的协同抗真菌效果。这种协同作用在低浓度下就能显著提高抗真菌活性。通过透射电子显微镜观察，丙酸铵和MCFA的组合处理导致真菌细胞结构出现扭曲和损伤，包括线粒体形态的异常变化，这表明可能发生了细胞自噬。使用oCelloScope微生物动态监测系统获得的生长曲线显示，丙酸铵和MCFA的组合处理延迟了真菌细胞的生长速率，并降低了其最大特定生长率。丙酸铵和MCFA的组合处理显著降低了真菌细胞的活性，增加了细胞损伤和死亡率。丙酸铵和MCFA的组合可能在饲料和食品储存领域具有重要的应用潜力，有助于减少真菌污染和延长产品货架期。
图1、不同处理方法对雪莲分生孢子的影响。分生孢子大小约为5μm。
图2、发芽的雪莲分生孢子的。在经过或未经处理的麦芽提取物培养基中孵育21小时后。a.)在对照培养基中可以看到许多芽管的发育。b.)PA1处理后可见一些芽管和肿胀的分生孢子。c.)经过M1处理的胚管d.)PAM1中的一些肿胀孢子。
图3、使用oCelloScope与各种成分一起孵育的单个分生孢子的延时。之间的时间间隔为2小时。
图4、与各种成分一起孵育的细胞的生长曲线。使用ocelloScope微生物动态监测系统的SESA NORMALIZED算法根据细胞边界内占据的总面积的增加并在6个孔中获得的生长进行计算。
图5、萌发分生孢子的比生长率。根据oCellscope软件的归一化SESA算法获得的数据计算得出的。R脚本使用各个孔中显示的生长曲线的4个连续点（log(1+x)值）。最大斜率被解释为特定增长率的指示。通过方差分析对这些值进行统计测试，然后进行事后Tukey检验。
总结
本研究旨在探究中链脂肪酸（MCFA）对丙酸铵配方的增强效果，评估其对饲料腐败真菌谢瓦列曲霉的休眠和发芽分生孢子、芽管和菌丝的抗真菌作用。通过实验室测试，使用不同浓度的丙酸铵和MCFA单独或组合处理，对谢瓦列曲霉的不同发育阶段进行了抗真菌效果评估。实验包括了对休眠分生孢子、发芽分生孢子、芽管和菌丝的观察和分析。研究发现丙酸铵和MCFA组合处理对休眠分生孢子具有显著的抗真菌效果，几乎完全抑制了菌落的形成。发芽率在16 mM丙酸铵和0.26 mM MCFA存在时显著降低，而单独使用MCFA时对发芽影响不显著。对菌丝的短暂处理显示，组合处理相比单独成分显著增加了细胞死亡。显微镜观察揭示了丙酸铵和MCFA组合处理导致细胞结构扭曲，包括线粒体形态异常，暗示了细胞自噬的发生。丙酸铵和MCFA的组合对谢瓦列曲霉的真菌生存结构在发芽和生长细胞的短暂处理期间具有协同抗真菌效果。这一发现对于饲料和食品储存领域具有潜在的重要性，有助于提高产品的安全性和延长保质期。oCelloScope微生物动态监测系统的使用为本研究提供了一种高效、精确的方法来评估不同抗真菌剂对真菌生长和发育的影响，这对于开发新的食品和饲料保存策略具有重要意义。