平湖红曲黄酒酿造过程中真菌菌群动态、红曲霉生长抑制因素（一）
红曲黄酒是中国黄酒的典型代表，因添加了红曲酿造，增加了酒体中的活性组分而备受推崇。红曲霉是红曲的优势菌，在红曲黄酒的酿造过程中发挥着重要作用。其一，红曲霉作为红曲黄酒酿造体系中的主要产色菌，其发酵产生的红曲色素（包括黄色素、橙色素、红色素3大类）可以赋予红曲黄酒特征的外观颜色；其二，红曲霉的次级代谢产物（红曲色素、莫纳克林K、γ-氨基丁酸、麦角固醇等）丰富了酒体的活性成分，增加了红曲黄酒的保健功能；其三，红曲霉强大的酶系能够催化底物生成醇类、酯类、有机酸等风味物质，丰富了酒体的口感和芳香。
由于红曲霉对红曲黄酒的色、香、味及保健功能等品质做出了较为突出的贡献，因此探明传统酿造过程中红曲霉的动态变化和生长机制尤为重要。研究发现红曲霉在红曲黄酒传统酿造过程中的菌量呈不断下降的趋势，对其原因并未深入探究。针对红曲霉生长的抑制因素，除了营养物质的消耗之外，其它微生物的生长代谢也可能会对红曲霉的生长产生影响。通过变性凝胶电泳技术揭示了红曲黄酒酿造过程中的优势细菌为乳杆菌，发酵液酸度的增加可能会抑制红曲霉的生长；通过宏基因组学技术对海派黄酒酿造过程中真菌菌群动态进行跟踪测定，试验结果表明曲霉属的相对丰度随酿造时间的延长有所下降，并指出影响其变化的原因可能与酸度、酒精度的增加有关。有学者表明，红曲黄酒酿造过程中pH值的变化在3.5～5.5范围内，此酸度适宜红曲霉的生长繁殖，且适宜浓度的酸、醇能够促进高温型红曲霉的生长。此外，酿造过程中的其它因素亦可能对红曲霉产生影响，这使得红曲霉与其生长抑制因素之间的关系变得复杂。
为探明红曲黄酒酿造过程中红曲霉的主要抑制因素，本研究将采用分子生态学PCR-DGGE技术及实时荧光定量PCR技术相结合的方法，对平湖红曲黄酒酿造过程中的真菌菌群动态进行定性、定量分析，并根据红曲霉菌量不断减少的趋势推测其中可能的原因，同时构造相应的体系进行验证，寻找影响红曲霉生长的关键因子，为探究红曲霉在发酵过程中的作用机制以及改善红曲黄酒的品质提供依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂
平湖红曲（Q01），福建省古田县平湖红酒曲有限公司；红曲霉C1，由平湖红曲中分离纯化而得，编号C1，由福州大学食品科学技术研究所保藏。圆糯米，福州市闽侯县上街镇粮油站；真菌基因组提取所需试剂、引物、PCR试剂盒、DNA Maker，上海生物工程有限公司；其它试剂均为分析纯级。
糯米培养基：用于液化液的制备；糯米和水按质量比1∶1.5的比例混合，在室温下浸泡8 h，121℃蒸煮20 min。
1.2仪器与设备
SW-CJ-IFD型超净工作台，上海博讯实业；GNP-9080型恒温培养箱，上海精宏；BIO-RAD DcodeTM型梯度变性凝胶电泳，美国伯乐公司；琼脂糖水平板电泳仪，北京六一公司；JS-380C型凝胶成像分析仪，上海培清；7890A气相色谱仪，安捷伦。
1.3试验方法
1.3.1平湖红曲黄酒酿造及取样过程将糯米浸泡蒸熟摊凉后，与研磨浸泡后的平湖红曲（Q01）搅拌均匀，放入灭菌后的酒坛中，25℃糖化5 d，再调整温度为18℃，密封发酵25 d。红曲与糯米按质量比1∶10添加，糯米与水添加比例为质量比1∶1.5。取样时间点设置为发酵前期（第1～7天）、中期（第10天）、后期（第20、30天）。
1.3.2发酵样品预处理发酵样品搅拌均匀后，取2.00 g，称于20 mL无菌生理盐水中，振荡均匀后分装于2 mL离心管中，12 000 r/min离心10 min，弃上清后，沉淀放置-20℃冰箱中冻存备用。
1.3.3孢子悬浮液的制备红曲霉C1活化结束后，用孢子洗脱液洗下孢子，转入带有玻璃珠的三角瓶中，振荡，充分打散孢子，用4层无菌擦镜纸过滤去除菌丝，利用血球计数板在光学显微镜下计数，制成终浓度为106个/mL的均一孢子悬液，备用。
1.3.4各体系红曲霉菌量变化的跟踪方法样品真菌基因组DNA的提取及实时荧光定量PCR分析。
1.3.5发酵体系的构建模拟传统：30 g蒸熟糯米、3 g红曲和45 mL无菌水，三者的质量比与酒坛酿造一致。
纯菌发酵：30 g蒸熟糯米、3 mL纯菌红曲霉（C1）菌液，补水至与模拟传统体系同体积。
体系1（除去曲米）：30 g蒸熟糯米、红曲处理上清液（3 g红曲研磨后加生理盐水充分振荡，静置分层，取上清液加入），补水至与模拟传统体系同体积。
体系2（抑制因子）：30 g蒸熟糯米、无菌的红曲处理上清液（3 g红曲研磨后加生理盐水充分振荡，静置分层，取上清液用0.22μm的无菌滤膜过滤）、3 mL纯菌红曲霉（C1）菌液，补水至与模拟传统体系同体积。
体系3（不同酒精度）：30 g蒸熟糯米、3 mL纯菌红曲霉（C1）菌液、不同体积的乙醇，补水至与模拟传统体系同体积，最终乙醇的体积分数分别为0，4%，13%，16%，25%，50%。
以上均在100 mL的锥形瓶中30℃下培养。
1.3.6酒精度的测定采用填充柱气相色谱法。
（1）色谱条件
色谱柱：10%PEG填充柱；载气：N2；进样量：1μL；空气流速：0.2 MPa；H2流速：0.05 MPa；载气流速：0.3 MPa；气化室温度：230℃；柱温：80℃；检测器温度：250℃。
（2）标曲的绘制
吸取无水乙醇配制成质量浓度分别为0，1.0000，1.5000，2.0000，2.5000，3.0000，4.0000 g/L的乙醇工作液，同时配制2.0000 g/L的正丙醇标准液，分别将各质量浓度的乙醇工作液与正丙醇标准液等体积混合后进样，每个样品重复2次，得到各质量浓度的乙醇工作液与正丙醇标准液的峰面积比Ai/As，以标样的峰面积比值的平均值为横坐标，乙醇的质量浓度为纵坐标，绘制标准曲线。
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