豨莶草果实内生细菌分离、鉴定、生长特性、抑菌效果及药敏分析（二）
2结果
2.1内生细菌的分离及抑菌效果
如表1所示，从豨莶草果实中共分离得到15株内生细菌，其中具有抑菌活性的8株，较明显的3株，编号为C-2、C-4、C-5-1，尤以菌株C-5-1的效果最好，对提供的几种病原细菌均显示出一定的抑制作用（金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌和大肠埃希菌中度敏感以上），图1为菌株C-5-1对铜绿假单胞菌的抑菌活性。说明该菌株是一种广谱的抗感染细菌且效果显著，具有较高的研究价值和应用前景。因此，本研究后续实验的开展就是以C-5-1为实验菌株。
表1豨莶草果实内生拮抗细菌的抑菌筛选
图1菌株C-5-1（A、C）和C-6（B、D）对铜绿假单胞菌的抑菌效果
2.2菌株C-5-1的鉴定分析
光学显微镜染色观察，菌株C-5-1的细胞呈杆状，芽孢侧生。革兰氏染色结果可变，对数期时染色结果为阳性，稳定期时变为阴性。
通过表2所得的16项生理生化试验结果，结合形态学特征，依据《伯杰氏细菌系统鉴定手册》，判断该菌株可能是侧孢短芽孢杆菌（Brevibacillus laterosporus）。
以菌株C-5-1的基因组DNA为模板，PCR扩增和测序获得了16S rRNA基因的部分片段（1 438 bp），NCBI GenBank登录号为KX170837。选择同源性较近的菌株与C-5-1构建系统发育进化树，结果显示（图2）该菌株与侧孢短芽孢杆菌的同源关系最近。结合形态学和生理生化鉴定结果，确定为侧孢短芽孢杆菌，该菌株被命名为C-5-1。
表2 C-5-1部分生理生化特征
图2基于16S rRNA基因序列相似性构建的系统发育树
2.3药敏分析
药敏试验结果（表3）表明，5种指示菌对氨苄西林均完全耐药，而本研究所分离得到的菌株C-5-1对氨苄西林是高度敏感的。因此，在后续摸索抗菌代谢物的纯化方案中，可以向LB固体培养基中加入适宜浓度的氨苄西林，以抑制发酵液和纯化液中菌株C-5-1的生长，而指示菌（铜绿假单胞菌）正常生长。
表3五种指示菌与侧孢短芽孢杆菌C-5-1的药敏分析
2.4菌株C-5-1的生长特性
分别测定细菌在不同酸碱度和盐度的生长特性，从而为该菌株的进一步培养和发酵利用提供依据。结果（表4）显示，侧孢短芽孢杆菌C-5-1在低pH环境中耐受性有限，在pH≤5.0时几乎没有生长，但在pH≥7.0时生长良好，并且随着pH值的升高，菌体量也一直在增加，这说明该菌株耐碱不耐酸。菌株C-5-1在NaCl盐度≤5%（相当于50 g/L）时正常生长，但随着盐度的增加该菌株的生长受到了一定的抑制，当盐度≥15%时，其生长受到了完全抑制甚至死亡。这是因为不同盐度能形成不同渗透压环境，造成细胞不同程度的脱水，从而降低生长速率，甚至失活。
表4侧孢短芽孢杆菌C-5-1生长特性值
2.5菌株C-5-1抗菌代谢产物的初步纯化
由表5可知，侧孢短芽孢杆菌C-5-1发酵液的乙酸乙酯相和水相都有明显的抑菌圈，直径分别为（28.3±0.8）mm和（29.9±0.5）mm，指示菌为铜绿假单胞菌，这说明该菌株不止产生一种抗菌物质。后又通过超滤离心管对二者进行了纯化，研究表明这两种抗菌代谢产物的分子量均小于2 000。
表5侧孢短芽孢杆菌C-5-1纯化液的抑菌活性
3讨论
内生细菌在适宜生境中能通过发酵获得大量目的活性产物，从而可以缓解某些药用植物资源短缺、生长周期长、生态系统损害等现象，并能为新药开发与濒危药用植物保护等难题提供重要思路。由于病原菌耐药性增加等问题的日益凸显，使得寻求天然、高效、绿色的替代品更加重要。
侧孢短芽孢杆菌最初是由Laubach于1916年从淡水中分离得到，并根据它的形态及生理生化特性将其归为芽孢杆菌属，到1996年，Shida等按近代生物分类学将其重新划分为短芽孢杆菌属。据报道侧孢短芽孢杆菌具有广谱抗菌活性，尤其是对细菌和真菌。近期的全基因组测序结果表明，侧孢短芽孢杆菌还具有产生聚酮化合物和非核糖体肽等多种抗感染药物的潜力，因此其医用功能潜力巨大。Barsby等从巴布亚新几内亚海岸热带海水中分离得到一株侧孢短芽孢杆菌，能产生聚酮类Basiliskamides等多种化合物，可以有效抑制大肠埃希菌和白色念珠菌。同样也是从海洋中分离得到的菌株PNG276能明显地抑制肠球菌的生长。Yang等从菌株OSY-I1分离到一种能抗革兰氏阳性菌生长的脂肽抗生素Brevibacillin。本研究从豨莶草果实中获得一株具有较强抗感染活性的耐碱侧孢短芽孢杆菌C-5-1，并且结合其代谢产物的物化性质，推测它们可能是新型抗菌物质。预示着该菌株具有非常高的开发价值，极可能取代部分抗生素进行应用。
由于后续对菌株C-5-1抗感染活性的研究是以其代谢产物为主，为了降低成本和缩短时间，本研究开展了实验菌株C-5-1与5种指示菌的药敏试验，以期筛选到对C-5-1高度敏感而对指示菌耐药的抗生素，结果表明氨苄西林能满足此要求。在测量抑菌活性时，首先向熔化的固体培养基中加入适宜浓度的氨苄西林，然后指示菌涂布于平板表面，并将待测样品直接置于平板中央0.8 cm的孔中。如果按传统做法，样品需要经过孔径为0.22μm的滤膜过滤后再加入。
4结论
豨莶草可作为优良微生物资源的来源，从而为开发新型天然抗感染药物提供宝贵的资源。
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