鼠疫耶尔森氏菌在3种选择培养基生长能力的测定——材料与方法
在鼠疫疫源地监测中，当动物鼠疫处于流行末期或静息期，由于鼠疫菌毒力减弱或完全丧失，不能致动物死亡，但存在于动物体内，由于菌量减少，若按一般常规培养基分离鼠疫菌比较困难，因此进行培养时必须要求特别敏感的增菌培养基分离鼠疫菌，而且自然界鼠疫菌一般从自毙动物体内分离，由于自毙动物腐败，从一个污染的材料中分离鼠疫耶尔森菌(鼠疫菌)，受变形杆菌、革兰氏阳性菌的影响鼠疫菌分离困难[1]。因此研制及应用一种分离鼠疫耶尔森氏菌的选择培养基，可以提高鼠疫菌的分离率，是野外鼠疫监测现场及实验室研究的关键技术。现有鼠疫菌的选择培养基主要有龙胆紫培养基，在实际工作中，这2种培养基分离污染材料中的鼠疫菌效果不理想，本研究根据鼠疫菌培养特性，在基础培养基中加入可以刺激鼠疫菌生长的生化试剂和抑制变形杆菌及革兰氏阳性菌的试剂，研制出2种选择敏感培养基(1%枸椽酸钠选择培养基和4%十二烷基硫酸钠选择培养基)，通过实验菌株在以上2种培养基的生长测试，并收集野外材料现场分离，比较2种选择敏感培养基对于鼠疫菌的检出性能和检测效果，初步评价其应用效果。
1、材料与方法
1.1材料
1.1.1腐败材料搜集野外动物材料(旱獭，犬)共5份，其中1号和4号旱獭仅剩股骨残骸，2号、3号旱獭及5号犬脏器高度腐败，但仍保留心、肝、脾、肺，各脏器均有不同程度溃烂。
1.1.2实验菌株
耶尔森氏菌属的鼠疫疫苗株(EV菌株)、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌以及野外腐败材料常见杂菌:变形杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、A群链球菌均由鼠疫菌专业实验室提供。
1.1.3仪器设备
丹麦Biosense微生物全自动菌落计数器，英国Symbioses公司;低氧细胞工作站H45 HEPA，英国DWS公司;Ⅱ级B2型生物安全柜，贺利氏HERAsafe生物，德国Heraus公司，中国细菌浊度标准管(批号2018-1)由中国药品生物制品检定所提供。
1.2方法
1.2.1基础培养基的制备
赫氏琼脂，含牛肉消化液200 m L，水800 m L，蛋白胨10 g，琼脂14 g，乳糖10 g，调p H7.2～p H7.4。对照培养基:1%溶血赫氏培养基，将基础培养基121℃高压灭菌30 min后冷却至50℃左右，冷却后加入10%脱纤维兔溶血，混匀后倾注平皿。
1.2.2龙胆紫培养基
龙胆紫0.1 g加无水乙醇2 m L溶解后，加蒸馏水至90 m L，121℃高压灭菌30 min高压灭菌后冷却至50℃加入新鲜血液10 m L，混合后取10 m L加入基础培养基1 L，制备成含有1/10万龙胆紫溶血琼脂培养基。
1.2.3 1号培养基
(4%十二烷基硫酸钠选择培养基)十二烷基硫酸钠4 g，红霉素0.5 mg，胆盐3号5 g，阿莫西林12.5 mg，甘露醇1 g，中性红0.03 g)。2号培养基(1%枸橼酸钠选择培养基)去氧胆酸钠1 g，枸橼酸钠1 g，枸橼酸铁1 g。将以上2种选择培养基试剂分别经121℃高压灭菌30 min后冷却至50℃的1000 m L基础培养基中，即组成不同的选择培养基，4℃保存备用。
1.2.4鼠疫耶尔森氏菌在3种选择培养基生长能力的测定
将鼠疫EV菌株28℃培养48 h，制成浓度为1000个菌/m L菌悬液，取0.1 m L分别接种以上3种选择培养基和对照培养基，置于28℃温箱培养24～48 h，实验重复3次，观察记录平板单个菌落生长情况。
1.2.5 3种培养基敏感性及特异性检测
将各实验菌株(耶尔森氏菌属的鼠疫EV菌株、假结核耶尔森菌、小肠结肠炎耶尔森菌)、野外腐败材料常见杂菌(变形杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、A群链球菌)制成菌悬液，根据比浊管稀释成1000个菌/m L菌悬液，取0.1 m L涂布到4种培养基上，实验重复3次，28℃孵箱培养24～48 h，观察细菌生长情况。
1.2.6腐败动物材料
鼠疫菌分离培养采集腐败动物脏器材料(旱獭和犬的股骨、肝、脾)，分别接种3种选择培养基，28℃孵箱培养24～48 h，观察鼠疫菌生长及分离情况。在各选择培养基上挑选可疑鼠疫菌菌落经鼠疫噬菌体实验确诊为鼠疫菌，以上实验均以1%溶血赫氏培养基为对照培养基。
1.2.7菌落计数参考《GB 4789.2—2016，菌落总数测定》。
相关新闻推荐
1、PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中对其生长状态、溶血酶活性及神经磷脂酶活性影响（二）