细菌悬液中活菌浓度的检测方法：平板点样技术VS传统平板涂布法
[摘要]目的比较平板点样法与传统平板涂布计数法，建立更为简便的细菌悬液中活菌浓度的检测方法。方法将3株A群溶血性链球菌制备成多份菌悬液，稀释成不同梯度，用调理吞噬实验中的平板点样技术和传统平板涂布法同时检测，比较两种方法计数结果，分析相关性和显著差异。结果不同菌株和稀释方法中平板点样法的结果均随菌液稀释梯度呈现出较好的梯度；两种方法计数结果呈高度相关（r=0.84）；二者的t检验结果比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论相对平板涂布法，平板点样法计数更客观准确，检测范围更宽，操作更便捷，适用于菌液浓度的确定。
在臨床细菌诊断试剂盒的评价过程中，菌液浓度的确定是参考品制备的关键步骤，因此菌液浓度的测定方法应当准确、便捷。目前，菌液浓度的测定和参考品的制备常用浊度法（包括比浊法、分光光度法等）和平皿计数法，但浊度法难以区分活菌与死菌，以及与微生物大小类似的杂质。传统用于测定菌液内活菌量的方法主要是平板涂布法。此方法虽结果较为准确，但可计数浓度范围窄，且人眼计数不够客观；操作复杂，所需时间较长，当制备大批量参考品时，其计数工作量也变得不可忽视，更易因疲劳而使误差变大。
平板点样计数法是调理吞噬实验（opsonophagocytic assay，OPA）中的细菌浓度检测方法。调理吞噬实验是评估肺炎球菌疫苗效价的实验方法，其原理是用肺炎球菌疫苗免疫后的血清样本（抗体）、HL-60细胞和补体构建体外型别特异性抗体介导的调理吞噬模型，对一定浓度的肺炎链球菌进行清除，之后通过检测体系中存活肺炎链球菌的浓度计算出血清样本中的功能抗体活力，实现对肺炎球菌疫苗保护效力的准确评估。近年来，美国阿拉巴马大学通过长期探索，建立了优化的多重调理吞噬实验（multiplexed opsonophagocytic killing assay，MOPA），可同时对4种血清型的肺炎球菌功能抗体进行检测，简化了实验流程，减少了工作量并节约血清样本，更使得OPA技术的检测通量成倍提高。此实验方法准确高效，被WHO推荐用于肺炎球菌疫苗的功能性抗体检测，且国外部分药企已经开始采用。其中检测存活肺炎球菌浓度所用的平板点样方法是该实验实现高效便捷的关键步骤。
在目前申报检验的临床细菌诊断试剂盒中，A群链球菌抗原检测试剂盒申报较多、应用较广，且A群链球菌与肺炎球菌寄生部位接近，培养条件较相似。因此本实验选用A群链球菌抗原检测试剂盒的国家参考菌株制备悬液，参考调理吞噬实验中平板点样的方法，同时与传统平板涂布法比较验证，建立一种更快速简便的活菌浓度检测法。
1材料与方法
1.1一般材料
菌株是由中国医学微生物菌种保藏管理中心提供A群溶血性链球菌CMCC32300、CMCC32301、CMCC32067。试剂是注射用生理盐水；MH培养基（Bacto）、羊血（陆桥公司）；Todd-Hewitt Broth（Bacto）、酵母提取物（Bacto）、琼脂（Bacto）、2，3，5-氯化三苯基四氮唑TTC（Amresco）、水。培养基为10%羊血培养基：MH培养基10.5 g；水500 mL；在使用前融化培养基，温度冷却至50～60℃时加入羊血50 mL混匀。THYA培养基：Todd-Hewitt Broth培养基12 g；酵母提取物2 g；琼脂6 g；水500 mL。上层培养基：Todd-Hewitt Broth培养基24 g；酵母提取物4 g；琼脂6 g；水800 mL。TTC储液：TTC 1.25 g；水50 mL，用0.22μm滤膜过滤除菌后，于4℃保存。溶液呈淡黄色；若颜色变红，废弃，重新制备。
1.2仪器
电子天平（ME204）购自瑞士METTLER TOLEDO仪器（上海）有限公司；恒温培养箱（LRH-250-Ⅱ）购自广东省医疗器械厂；恒温水浴锅（XMTD-6000）购自北京市长风仪器仪表公司；超净工作台（SG-603TX）购自BAKER公司；立体菌落计数仪购自丹麦Biosense公司；显微镜（BX51）购自日本OLYMPUS公司；振荡器（QL-901）购自海门市其林贝尔仪器制造有限公司。
1.3样品制备
1.3.1菌悬液制备将A群溶血性链球菌CMCC32067、CMCC32300、CMCC32301冻干粉复苏后，制成悬液涂布在羊血培养基平板上，在37℃过夜培养。将平板上的菌体刮至10 mL注射用生理盐水中，制成均一菌悬液。
1.3.2梯度稀释将CMCC32067制备7份菌悬液，将其中5份进行1/10系列稀释8个梯度，另外2份做1/2系列稀释18个梯度；将CMCC32300和CMCC32301各制备1份菌悬液，并进行1/10系列稀释8个梯度。
1.4平板点样
1.4.1培养基准备将THYA培养基融化后，倒于13 cm×13 cm方形培养皿中，25 mL/板；凝固后在超净台内开盖吹30～45 min，备用。将上层培养基融化后保存于50℃水浴中1～2 h，确保温度至50℃，备用。
1.4.2平板点样1/10梯度稀释每个浓度菌液以及1/2梯度稀释的后8个浓度的菌液，分别取10μL滴在THYA方形培养皿左侧，每点完一个样品立即倾斜平板，使菌液滴流成2～3 cm长，每个梯度做两个平行。待所有样品点完后，室温放置20～30 min，让菌液吸收到琼脂板上。从水浴中取出上层培养基，取25 mL入25μL TTC储液混匀，从板子边缘缓慢倾倒在点样的THYA平板上。待上层培养凝固，倒置于37℃孵箱中培养过夜，
1.4.3菌落计数用菌落计数仪统计每个点样条的菌落数。
1.5平板涂布
分别取各系列菌液中的部分梯度50μL或100μL菌液均匀涂布于羊血平板，各做两个平行，倒置于37℃孵箱中培养过夜，手动计数。
1.6统计学方法
将7份菌悬液的各稀释梯度用两种平板计数法计数，再用各个梯度的计数结果分别折算出初始浓度，采用SPSS 13.0对两组结果进行相关性分析和成对t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2、结果与讨论
在本实验中，用不同菌株、不同稀释方法且多次重复试验，平板点样法的结果均随菌液稀释梯度呈现出较好的梯度。比较了平板点样法与平板涂布法计数7份CMCC32067的菌悬液的不同浓度梯度，以及不同的血平板点样量，结果均显示出高度相关性，且差异无统计学意义；用两种平板计数方法计算另外两株A群溶血性链球菌菌液浓度，同样具有较好的一致性。比较两种计数方法的操作性和准确性，发现平板点样法点样区域小、点样量少，计数简便，因而可检测的浓度范围比平板涂布法较宽。
用多個稀释度的浓度检测结果计算初始菌液浓度显示，测定结果随稀释度提高略有升高，分析原因可能为：①存在稀释过程中的操作误差；②点样区域有限，在稀释度低时菌液浓度高，菌落密集且大小不均，容易漏计或合并计数，造成计算结果偏低；高稀释度时菌液浓度低，菌体可能未落在点样区域，造成平行孔之间CV值较大，浓度计算不准确。根据结果分析，选择菌落数在20～100个之间的点样区计算菌液浓度的偏差较小，点样浓度最好在2×104～2×102 cfu/mL，将同一菌液的多个梯度的计数结果平均，计算初始菌液浓度更为准确。
由于平板点样法所需样品量少、点样区域小，可以在一块方形培养皿里同时检测多个稀释度或多种菌液。若待检样品多，还可以将初始菌悬液用移液器在96孔板中梯度稀释后，再用多道移液器同时点样多个梯度或多种菌液，操作更加便捷。且此方法用仪器自动计数，并且可以根据情况进行手动调整，准确度和效率更高，减少了传统平板涂布法的涂布不均和人眼计数误差。
对于其他细菌检测试剂盒，当制备试剂盒评价参考品时，如果其抗原菌株不能在THYA培养基上生长，如淋病奈瑟菌等，在测定参考品浓度时可筛选出适宜其生长的且透明度好的培养基点样，以便于TTC显色后用仪器计数，这部分研究将在本室的后续工作中进行。
综上所述，相较于平板涂布法，用平板点样法检测菌液浓度更加快捷，简便，上样量少，且检测结果更准确客观，检测范围宽，平均多个梯度后计算更加缩小了误差，可以用于大批量试剂盒参考品的制备。