拮抗菌生长曲线测定、鉴定及对烟草赤星病室内防治效果（二）
2结果与分析
2.1拮抗菌的筛选及抑菌谱测定
从采集的土壤中分离纯化后共获得96株芽胞杆菌，通过对峙培养筛选到1株具有较好拮抗作用的菌株（图1），编号为L249。该菌对5种植物病原真菌均具有良好抑制作用，抑制率均在60.00%以上（表2），其中对链格孢菌的抑制效果最好，抑制率达72.27%。
图1菌株L249对4种植物病原真菌的抑制作用
表2菌株L249对5种病原真菌的抑制作用①
培养7 d后，挑取链格孢菌菌丝在蔡司显微镜下观察，发现对照菌丝挺直，粗细均匀，而与L249对峙培养后，菌丝出现粗细不均匀、旋转结节及肿大等现象（图2）。
图2菌株L249对链格孢菌的拮抗效果
A.链格孢菌单独培养B.菌株L249与链格孢菌对峙培养C.单独培养的链格孢菌菌丝（100×）D.与L249对峙培养7d后的链格孢菌菌丝（100×）
2.2生长曲线测定
生长速率测定结果表明（图3），菌株L249在0~2 h内生长较慢，处于延滞期，2~4 h生长逐渐加快，4 h后生长速率剧增，进入对数生长期，4~6 h生长速率最快，6~14 h菌株生长量持续增加，14 h后OD600值达到最大。培养16~26 h后菌株生长量基本保持不变，到达稳定期，26 h以后开始下降，进入衰亡期。
图3菌株L249的生长曲线
2.3生物膜和生防相关酶类检测
如图4所示，菌株L249在液气交界处能形成复杂的生物膜结构，可在蛋白酶和纤维素酶平板上产生透明消解圈，表明该菌可产生蛋白酶和纤维素酶。
图4菌株L249菌落形态、生物膜、蛋白酶和纤维素酶检测
2.4拮抗菌L249鉴定
2.4.1菌落形态及生理生化特性
菌落形态观察发现（图4），菌株L249在LB培养基平板上呈乳白色，菌落表面有褶皱，边缘不整齐。菌株的生理生化特征如表3所示，菌株L249革兰氏染色为紫色，能产生多种水解酶，明胶液化、甲基红试验及V-P试验等反应均呈阳性，柠檬酸钠盐利用、苯丙氨酸脱氢酶和吲哚试验等反应均呈阴性且具有较好的耐盐性。
表3菌株L249的生理生化特征①
2.4.2系统发育分析
基于16S rDNA和gyrA基因序列构建了菌株L249的多基因系统发育树（图5），结果显示菌株L249与枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis NRRL B-4219*）聚为一支，且支持率为100%，结合其形态特征、生理生化特性及系统发育分析，将其鉴定为枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）。菌株L249的16S rDNA和gyrA基因序列已提交GenBank数据库，登录号分别为MT786346和MT802123。
图5基于16S rDNA和gyrA基因序列构建的进化树
2.5盆栽防病试验
盆栽试验结果表明（表4），L249发酵液对烟草赤星病具有明显防治效果，经其处理后烟株发病率和病情指数均显著低于对照，相对防效为60.66%，与10%苯醚甲环唑WDG的相对防效无显著差异。
表4拮抗菌L249发酵液对烟草赤星病的盆栽防治效果①
3讨论
本研究中从烟草根际分离得到一株具有较好拮抗作用的枯草芽胞杆菌L249，该菌对链格孢菌、高粱叶点霉菌、大斑突脐蠕孢菌、烟草炭疽菌及尖孢镰孢菌等5种病原真菌均有一定抑制作用，表现出良好的广谱抑菌活性，具有潜在的生防利用价值，这与王欣悦等对枯草芽胞杆菌抑菌机制的研究结果一致。对峙培养观察发现，枯草芽胞杆菌L249可以有效抑制链格孢菌生长并造成菌丝生长稀疏和膨大畸形，这与任建雯研究贝莱斯芽胞杆菌B56与链格孢菌对峙培养后，菌丝也出现断裂增多、膨大畸形及生长速度变慢等现象相似。本研究中还发现枯草芽胞杆菌L249能形成生物膜，可产生蛋白酶、纤维素酶及硝酸还原酶等生防相关酶类降解病原真菌细胞壁从而抑制病原菌生长，这与马佳等研究解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）B501抑菌机制的结果相符。枯草芽胞杆菌L249生长曲线结果表明，该菌延滞期短，4 h就进入对数生长期，14 h便达到最大生物量。菌株发酵时间短、生物量大及活力强，可节约生产成本，为今后工业化应用提供了理论依据。
本研究中测定了烟草赤星病的室内盆栽防效，结果发现，菌株L249发酵液处理烟叶后，可显著降低烟草赤星病的病情指数，相对防效达60.66%，与罗楚翔等和叶爱萍等研究枯草芽胞杆菌对烟草赤星病的室内防效相比存在一定差异，推测这可能与供试枯草芽胞杆菌来源不同有关。除对烟草赤星病有较好防治效果外，枯草芽胞杆菌对其他植物病害也有良好防治效果。本试验仅用枯草芽胞杆菌L249对烟草赤星病进行室内防效测定，该菌对其他植物病害是否也具有较好的防治效果还有待进一步验证。
4结论
从贵州省清镇市卫城镇烟区健康烟草根际土壤中分离到一株对链格孢菌有明显拮抗作用的菌株L249，经鉴定为枯草芽胞杆菌。该菌能有效抑制链格孢菌菌丝生长并造成菌丝膨大畸形，且对高粱叶点霉菌、大斑突脐蠕孢菌、烟草炭疽菌及尖孢镰孢菌等4种病原真菌也有一定抑制作用。该菌生长速度快，培养14 h可达到最大生长量。菌株L249能产生形态结构复杂的生物膜，能产蛋白酶、纤维素酶及硝酸还原酶等生防相关酶类，盆栽试验表明其发酵液可有效降低烟草赤星病的病情指数。