产单核细胞李氏杆菌噬菌体分离、超离、宿主谱鉴定及生长曲线绘制（一）
李氏杆菌可污染奶制品、肉制品、水产品以及即食食品等，是重要的食源性致病菌之一。目前常见的李氏杆菌共有7种，其中,产单核细胞李氏杆菌(，)是唯一能引起人类疾病的。当摄入被产单核细胞李氏杆菌污染的食品后，孕妇、婴幼儿及老人等免疫低下人群极易罹患李氏杆菌病，其致死率高达23.6%。由于缺乏完善的监测系统，产单核细胞李氏杆菌的低温生长等特性，李氏杆菌病仍作为世界四大食源性疾病，给人畜带来严重危害。
由于过度使用抗生素导致细菌耐药性增加和超级细菌的出现，有望将噬菌体视为可能的抗生素补充或替代品。噬菌体在治疗细菌性感染方面，较抗生素其优势：严格的宿主特异性、增殖速度快、研发时间短、成本低、安全无污染等。基于以上特点，虽然国内外已有将噬菌体用于疾病治疗及食品生产加工方面的报道，但噬菌体的应用也存在一些缺陷。由于噬菌体的高度特异性，单一的噬菌体或给药途径的治疗方式，效果并不十分明显。根据目前对其他噬菌体的研究发现，噬菌体和抗生素联用取得的效果比单一噬菌体或抗微生物药物给药所取得的治疗效果更为显著。
本试验主要利用实验室保存的产单核细胞李氏杆菌为宿主菌，使用双层琼脂平板法从屠宰污水样品中分离出噬菌体，通过对其形态学、生物学、基因组学等方面进行鉴定。旨在评价分离到的噬菌体在预防和治疗产单核细胞李氏杆菌病过程中的效果以及应用价值，为实验室后续建立产单核细胞李氏杆菌噬菌体库和基于产单核细胞李氏杆菌噬菌体的应用提供基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1样本来源分别从甘肃省定西市、武威市某屠宰场，采集污水样品，4℃保存。
1.1.2菌株来源甘肃农业大学动物医学院公共卫生实验室保存的产单核细胞李氏杆菌、威尔斯李氏杆菌和英诺克李氏杆菌。
1.2分离和纯化
离心并过滤后的样品进行共孵育，37℃，震荡培养24 h，分离时采用双层琼脂平板法，琼脂比例为上层1.2%，下层0.5%。挑取单个噬菌斑，进行双琼脂平板培养，重复5～6次，得到单一噬菌体。
1.3浓缩和超离
噬菌体裂解液与宿主菌各100μL混合，37℃，共孵育15 min后，加入100 mL TSB-YE培养基中，37℃，220 r·min培养12 h，利用PEG8000沉淀法进行沉淀。对噬菌体浓缩液进行氯化铯密度梯度离心，进一步提高效价以及纯化噬菌体颗粒(噬菌斑的解离条件为4℃过夜解离，浓缩中加入PEG8000后冰浴4 h)。
1.4效价的测定
噬菌体浓缩液进行10倍连续梯度稀释。选取合适的梯度进行培养、计数，重复3次，取平均值。噬菌体效价(滴度)的计算方法：
噬菌体效价(PFU·mL)=密度适当平板上的噬菌斑数×稀释倍数×10。
1.5电镜观察
取5μL超速离心后的噬菌体样品滴加到300目铜网上吸附10 min。滤纸吸干噬菌体溶液，滴加5μL的1%磷钨酸溶液复染2 min后，吸除染液。室温晾干后，电镜观察。
1.6生长特性鉴定
1.6.1宿主谱的测定利用不同菌株与噬菌体LP8进行混合孵育后，利用双层琼脂平板法计算噬菌体效价(PFU)，计算宿主菌与受试菌电镀效率(EOP)，计算公式为EOP=受试菌平均PFU/宿主菌平均PFU。
1.6.2温度设定25、35、45、55、65、75℃不同的温度梯度，将噬菌体裂解液置于其中孵育30 min后进行培养，根据平板计数确定该噬菌体的最适温度和失活温度。
1.6.3 pH将噬菌体液加入pH为2、4、6、7、8、10、12的SM缓冲液中，37℃孵育1 h，通过培养来确定该噬菌体的最适pH。
1.6.4有机溶剂在噬菌体液(1×10PFU·mL)中等体积加入异戊醇、丙三醇、甲醇、乙醇、氯仿和硫酸镁缓冲液(SM缓冲液)。37℃作用30 min后，测定效价。
1.6.5一步生长曲线测定通过对噬菌体-宿主菌共培养液，不同时间点(10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min)取混合物进行培养，测定噬菌体的效价，绘制一步生长曲线，确定噬菌体的潜伏期等。
1.6.6最佳感染复数(MOI)测定对细菌和噬菌体进行定量，设置不同的感染比例(0.001、0.01、0.1、1、10、100)进行共孵育，培养后计算出不同感染复数下的噬菌体效价(见“1.4”)，试验重复3次，并确定噬菌体的MOI。
1.7全基因组测序
利用Tris法对噬菌体超离液中的噬菌体颗粒进行基因组提取。在所提取的基因组中加入DNaseⅠ、RNaseⅠ和绿豆核酸酶，对基因组进行酶切、电泳，鉴定基因组类型。将成功提取的噬菌体基因组送至广东惠通生物科技有限公司，采用Illumina测序技术完成噬菌体基因组扫描测序，构建了Illumina PE文库，对获得的测序数据进行质控后利用生物信息学分析手段完成噬菌体的全基因组组装。利用基因组绘图软件Snap Gene绘制基因组图，对其相应基因进行预测分析。