白色念珠菌快速鉴定培养药敏试剂盒检验原理、方法及效果评估
念珠菌性阴道炎系念珠菌侵犯外阴和(或)阴道浅表上皮细胞所致的炎症过程，表现为外阴瘙痒和阴道分泌物异常的感染性疾病。念珠菌性阴道炎是妇女从青春期到绝经期前、后最常见的一种阴道炎，病原菌以白色念珠菌为多见。近年来，随着真菌感染不断增多以及抗真菌药的广泛应用，真菌耐药现象日益严重。《抗菌药物临床应用指导原则》明确指出，念珠菌性阴道炎必须进行细菌培养，获得病原菌后进行药敏试验，根据不同病原体选择抗菌药物。常规的细菌培养和药敏试验一般需要2～3 d，加上门诊患者对治疗的急切需求，经验治疗与药敏试验的滞后易造成病情的延长与反复。因此，快速、准确地从标本中检出病原菌，尽早获得药敏试验结果，对于疾病的早期诊断和治疗有着十分重要的意义。本研究采用白色念珠菌快速鉴定培养药敏试剂盒，对门诊念珠菌性阴道炎患者的阴道分泌物进行鉴定和直接药敏试验，现报告如下。
1材料与方法
1.1菌株来源
选取2013年9月—2014年8月阴道分泌物常规检测中找到念珠菌的门诊患者，共205例，年龄19～41岁。由妇科医师取无菌棉拭子经窥阴器进入阴道，取后穹窿或阴道上端分泌物置于无菌管中。
1.2仪器与试药
生化培养箱LRH-250A(广东省医疗器械厂);白色念珠菌快速鉴定培养药敏试剂盒(第四军医大学研制，陕西百盛园生物科技信息有限公司生产)。试剂盒检验原理:白色念珠菌利用培养基中的营养成分进行增殖，分解糖类，产生氢离子，使培养基的pH值降低，使培养基中的指示剂由原来的绿色转变成黄色;药敏板中有9种抗真菌药，利用这9种抗真菌药高、低浓度在体外对微生物生长的抑制作用，对微生物进行耐药性分析。
1.3方法
按白色念珠菌快速鉴定培养药敏试剂盒说明书的要求操作。采集标本后的棉拭子用1.5 ml无菌0.9%氯化钠注射液充分稀释，取50μl稀释液加入配好的培养基溶液内，混匀后各取50μl加入药敏板孔中，盖上药敏板盖。将剩余的培养基连同药敏板一起置于35℃培养箱，24 h后观察结果。按白色念珠菌快速鉴定培养药敏试剂盒说明书来判断试验的有效性及药敏试验结果。
2结果
205例念珠菌性阴道炎患者的阴道分泌物中，共173例检出白色念珠菌，检出阳性率为84.39%。173株白色念珠菌快速药敏试验结果显示，克霉唑的敏感性最高，其次分别为氟康唑、酮康唑;制霉菌素的耐药率超过50%，见表1。
表1 173株白色念珠菌快速药敏试验结果［例(%)］
3讨论
念珠菌性阴道炎的复发率较高，药物的不规范治疗是造成耐药菌株增多的主要原因之一。经验治疗易造成病原菌的逃逸、增加疾病的复发率及耐药菌的出现。大多数念珠菌性阴道炎根据显微镜检查可诊断，最可靠的方法是进行细菌培养。念珠菌的种属为最重要的因素，其决定了抗真菌治疗的效果，对于严重与复发阴道炎的治疗非常重要。病原体培养和药物敏感性测定可以最终确定病原微生物以及提供有效的用药指导。
常规病原菌培养及药敏试验耗时较长，且常规的ATB Fungus 3真菌药敏试剂盒中只有两性霉素B、氟胞嘧啶、伊曲康唑、氟康唑与伏立康唑等5种抗真菌药，不能对目前临床上常用的栓剂如咪唑类的克霉唑、咪康唑、酮康唑及多烯类的制霉菌素进行药敏试验。本研究采用快速鉴定培养药敏试剂盒检测阴道白色念珠菌，试验结果通过颜色的变化来判断，比常用的纸片扩散法测量抑菌圈的操作更简便，检出阳性率为84.39%，与报道的常规培养法的检出有效率相近。
快速鉴定培养药敏试剂盒仅需24 h，培养、鉴定及药敏试验即一步完成，就诊次日即可获得试验结果，比常规试验至少提前48 h，减少了经验用药的盲目性，提高了药物治疗水平;此外，对临床常用的9种抗真菌药均进行药敏试验，增加了选药的依据。试验操作过程中发现，试验结果的准确性与菌液浓度及培养时间密切相关。菌液浓度过高会造成药敏试验假耐药结果，浓度过低会造成鉴定试验假阴性或药敏试验假敏感结果;试验盒操作规程未对菌液浓度作详细说明，且原始标本的浓度差异较大。本试验用比浊仪将菌悬液调为2麦氏浊度，试验结果的重现性较好。为保证菌落有足够的繁殖时间，标本在培养箱中至少放置24 h，但不宜超过72 h，时间过长易造成药敏试验假耐药结果。据文献报道，白色念珠菌在阴道中的耐药性因不同时间、不同地区而有较大差异。
本次试验检测出的白色念珠菌对9种抗真菌药呈现不同程度的敏感性，与各地区的报道不尽一致。试验结果显示，克霉唑对白色念珠菌的敏感性最高(93.06%)，其次分别为氟康唑(79.19%)、酮康唑(71.10%);伊曲康唑、氟胞嘧啶及咪康唑的耐药率超过40%，应慎重经验用药;制霉菌素的耐药率超过75%，应暂停临床应用，追踪耐药监测结果。根据流行情况、临床表现、微生物学、宿主情况，念珠菌性阴道炎可分为单纯性和复杂性，90%的初发患者为单纯性。
对于单纯性念珠菌性阴道炎，相关指南推荐短期口服或局部治疗，局部治疗可选用克霉唑、咪康唑或制霉菌素，其疗效相仿，口服可选氟康唑或伊曲康唑。结合本试验结果，作为经验治疗，可首选克霉唑局部用药或口服氟康唑。复杂性念珠菌性阴道炎相对少见，据报道，约92%复杂性念珠菌性阴道炎患者的病原体仍为白色念珠菌。复杂性念珠菌性阴道炎的治疗难度大，病原学结果对诊疗至关重要，病原体需考虑是否为白色念珠菌的耐药株或不敏感株，或者为对氟康唑天然不敏感的非白色念珠菌(如克柔念珠菌或光滑念珠菌)。对于上述氟康唑治疗无效的菌株，相关指南建议使用伊曲康唑。文献报道，伊曲康唑治疗念珠菌性阴道炎，显著疗效、不良反应发生率较低、给药方便且疗程较短。但本试验结果显示，伊曲康唑对白色念珠菌的敏感性仅为27.74%。由此可见，应结合药敏结果选用药物。
真菌感染是一个复杂的过程，影响抗真菌药疗效的因素很多，如药物在感染局部组织中达到的浓度等;同时，体外药敏试验结果与疗效之间只能是在一定程度上相关。需注意的是，对于无症状、体征的患者，念珠菌培养阳性并不是治疗的指征。念珠菌性阴道炎的症状和损害通常在有效治疗48～72 h后缓解，但真菌学检查阴转通常在治疗后4～7 d，而抗念珠菌的初步治疗应持续至患者的症状消失及念珠菌培养阴性。因此，及时、准确的病原学结果，对实际抗真菌治疗的疗程有一定的指导意义。
综上所述，相比于常规的试验方法，快速试验法操作简单、标本易获取、试验耗时短，对病原菌的及早判断与制订正确的治疗方案有着重要意义，有利于临床准确用药，值得推广。但该试验方法尚处于起步阶段，距离成为一种标准化的试验方法还有相当差距，仍需大量的研究工作来完善。随着耐药菌株的不断增加，对临床分离的致病念珠菌进行耐药性监测并正确、合理选择抗真菌药非常重要。念珠菌性阴道炎的治疗目的是消除症状，防止复发，尽可能减少治疗的不良反应。应综合考虑病原菌、患者个体差异和抗真菌药的药动学/药效学特点，给予优化治疗。