撒坝猪耳缘组织成纤维细胞系生长曲线、生物污染检测结果——材料与方法
摘要：实验采用撒坝猪耳缘组织块贴壁培养法首次对撒坝猪成纤维细胞进行体外培养，通过原代培养、传代培养、冷冻保存建立了撒坝猪耳缘成纤维细胞系；并对其细胞形态、细胞活率、细胞核型等生物学特性进行分析；还利用透射电镜观察了耳缘组织细胞。结果表明：细胞倍增时间为48 h，生长曲线为“S”型；染色体中正常二倍体染色体(2n=38)所占比例为92.56%；细菌、真菌、病毒和支原体等微生物污染检测均显示为阴性。透射电镜观察显示，成纤维细胞呈长梭型。
随着全球生物多样性及其遗传资源丧失程度的加剧，使得各国纷纷投入大量人力和财力，并以多种方式收集、保存和整理大自然赋予人类的宝贵财富，如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)，欧洲动物细胞培养物保藏中心(European Collection of Animal Cell Culture，ECACC)都相继保存了大量生物资源的培养物。
云南地方物种丰富，撒坝猪是云南省优良的地方猪种，耐粗饲、抗病力强、肉质好(味好鲜嫩)，为农民增收做出了极大的贡献，是较好的地方品种。作为我省的特色品种，为了更好地保护和利用撒坝猪遗传资源，非常有必要开展撒坝猪种质资源保存研究。与传统的活体保存相比，体细胞保存具有占用场地小、投资少、不受群体和个体生理利用年限制约、可以长期保存种质资源等优势。为加强撒坝猪这一独特地方品种保护，本试验以撒坝猪耳缘组织为材料，体外培养和建立了成纤维细胞系，并对其生物学特性进行了研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验材料：撒坝猪来源于楚雄州种猪场，试验用组织块来源于2月龄撒坝猪耳缘组织。
1.1.2主要试剂、仪器：胎牛血清(FBS)、高糖DMEM由Gibco公司生产。胰蛋白酶和青链霉素溶液购自Bioind公司；一次性塑料培养皿为Nunclon公司生产。
主要仪器设备：CO2培养箱(Thermo)、倒置相差显微镜(Olympus，Nikon)、透射电镜(JEM-1011)、实体显微(Olympus)、微生物立体计数仪等。
1.2方法
1.2.1耳缘组织成纤维细胞的分离培养
撒坝猪耳缘组织剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。取耳缘组织样本0.6 cm×0.6 cm，75%酒精浸泡2 min，然后用生理盐水+1%青链霉素溶液洗3次，放入高糖DMEM+1%青链霉素中，放入4℃泡沫箱，确保24 h内带回实验室进行培养。超净台上剪刀刮去皮肤表面污物。PBS清洗4次后，用手术剪和镊子剪成碎块，放入直径为50 mm培养皿中，每皿8块左右进行培养。所用培养液为：高糖DMEM+10%FBS+1%青链霉素。最后放入培养箱(37℃，5%CO2，饱和湿度)中培养。每天在倒置显微镜下观察、照相，记录细胞迁移和增殖情况。
1.2.2成纤维细胞传代培养
当细胞长至培养瓶(皿)底壁80%左右时，PBS清洗3次，加入0.125%胰酶(含0.01%EDTA)37℃消化5 min后，倒置相差显微镜下观察。当细胞开始变圆时，加细胞培养液终止消化，吹打细胞使其完全脱落，以1∶2或1∶3的比例进行传代。倒置相差显微镜下观察传代细胞生长增殖状况，并拍照。传代培养液与原代培养液相同。
1.2.3成纤维细胞冷冻与复苏
胰酶消化收集细胞，1 200 r/min离心5 min，弃上清，用冻存液调整细胞浓度为1～3×107/mL左右，充分混匀，分装于冻存管中。标明细胞名称、冻存管编号、性别和冻存日期。-80℃冰箱过夜，次日投人液氮罐中长期保存。细胞冻存液为高糖DMEM+30%FBS+10%二甲基亚砜(DMSO)。
细胞复苏时将冻存管从液氮中取出，迅速投人42℃水浴锅中1 min，不停摇动使其受热均匀。转移至离心管中离心，弃上清，加入细胞培养液重悬细胞。移至培养瓶中，在37℃、5%CO2的培养箱中培养。倒置显微镜下观察复苏细胞生长状况，并拍照。
1.2.4耳缘组织透射电镜观察
撒坝猪耳缘组织剪毛后，用碘伏消毒，并用75%的酒精擦拭。用消毒好的耳号钳取材后，用锋利的手术剪立即剪小并放入装有3.5%戊二醛的离心管中固定，放入4℃泡沫箱，送昆明医学院电镜中心进行透射电镜分析。
1.2.5成纤维细胞生长曲线测定
取传至第2代的撒坝猪成纤维细胞，胰酶消化后，制成单细胞悬液，调整细胞密度为1×105个/孔，接种于24孔培养板。从第2天开始到细胞长满，每天随机取3孔，连续7 d记数。用血球计数板在倒置相差显微镜下计数，取其平均值，以时间(d)为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。
1.2.6撒坝猪成纤维细胞的核型检测
取培养至汇合度为85%左右，并处于对数生长期的细胞为试验材料，参照Sun Y L方法进行染色体制备。
1.2.7细胞活率测定及微生物检测
对冻存前后的第2、4、6代细胞进行PI染色，统计计算细胞存活率。微生物检测参见Doyle，Hay RI和Guan等。
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