不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响——摘要、结论与讨论
摘要：维生素B12(Vitamin B12)又称钴胺素，通常用来表示含钴离子的类咕啉(corrinoid)化合物，最早作为“抗恶性贫血因子”在1926年发现。作为一种重要的生理活性物质，维生素B12是许多重要生物化学反应所必需的辅酶，如分子内重排作用、由三磷酸核糖核苷酸生成2′-三磷酸脱氧核糖核苷酸的还原反应、分子间甲基转移反应等。
由于维生素B12的分子结构极为复杂，其全化学合成需要多达70余个的反应步骤，且成本昂贵，故目前几乎都是通过微生物发酵的方式来生产维生素B12。而具备维生素B12合成能力的微生物有很多种，但目前成功应用于工业化发酵生产维生素B12的菌株主要有费氏丙酸杆菌(Propionibacteriumfreudenreichii)、谢氏丙酸杆菌(Propionibacteriumshermanii)和脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)等。其中，脱氮假单胞杆菌更是因为其维生素B12产率高，而成为当前应用最广的维生素B12生产菌株。尤其是通过一系列发酵工艺的优化，脱氮假单胞杆菌的维生素B12工业化发酵水平近年来得到了大幅度的提高，稳定在200 mg/L以上。
并且经过几十年研究，脱氮假单胞杆菌中维生素B12生物合成途径已经得到阐明。Wang等利用13C同位素标记代谢流分析的方法考察了维生素B12产生菌脱氮假单胞杆菌的中心代谢网络，发现糖酵解途径(EMP途径)的代谢活性很低，主要利用ED途径分解代谢葡萄糖，并且存在较大通量的磷酸戊糖途径(HMP途径)。有文献报道柠檬酸钠结合葡萄糖代谢能阻止微生物发酵过程中副产物的合成，柠檬酸钠作用于微生物发酵的探究也逐渐深入。刘新星等和陈双喜等发现柠檬酸钠能减弱丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的活性，并能抑制EMP途径和TCA循环之间的“碳源溢流”，增加HMP途径的通量，大幅度提高肌苷产量。随后，大量的文献报道，添加柠檬酸钠能在不影响菌体正常生长的情况下，减少发酵副产物的生成，改变目标产物合成途径关键点的代谢流分布，提高目标产物合成途径的代谢流量，提高胞内NADPH、NADH和ATP的水平，促进目标产物的合成和积累。
因此，本文通过摇瓶培养的方式，结合酶学方法，从发酵液pH、菌体生长量、维生素B12产量、有机酸含量和糖代谢途径的关键酶活力等角度出发，考察了不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响，并总结出添加浓度为0.3%的柠檬酸钠最有利于脱氮假单胞杆菌发酵产维生素B12。
结论与讨论
由于维生素B12的化学结构非常复杂，合成过程高度繁琐。使得应用化学方法来工业化生产维生素B12在技术上存在很大的难度，成本十分昂贵。而在脱氮假单胞杆菌发酵产维生素B12过程中，添加一些维生素B12合成所必需的化合物是非常必要的。例如钴离子和5，6-二甲基苯并咪唑。另外，在发酵培养基中添加甘氨酸、苏氨酸、5-氨基乙酰丙酸、甜菜碱和胆碱等甲基供体，也能促进维生素B12的合成，特别是胆碱能增加膜透性。除此之外，不同的无机氮源对P.denitrificans代谢产维生素B12的影响也是不一样的，彭卫福等通过研究发现，硫酸铵是维生素B12发酵较为适宜的无机氮源，高浓度的NH4+能明显促进菌体的生长，但是会对维生素B12的合成产生一定的负作用。
为了进一步阐明柠檬酸钠添加对P.denitrificans代谢途径所产生的影响，研究发酵过程有机酸和糖代谢途径关键酶酶活力的时序性动态变化发现：在TCA循环中，琥珀酸是由琥珀酰CoA水解生成，而琥珀酰CoA是脱氮假单胞杆菌合成维生素B12的重要前体物质。由此可见，柠檬酸钠抑制琥珀酸的生成，可能会使得大量的琥珀酰CoA得以流向维生素B12合成途径。另外，柠檬酸钠促进苹果酸的快速利用，产生大量的还原力NADH，更好地满足了维生素B12合成所需。本文所测定的5个酶均为代谢网络中的关键酶，根据Wang等的研究结果，并结合前文中维生素B12合成量分析推测，在脱氮假单胞杆菌中心代谢途径中存在较大通量的HMP途径，这可能是HMP途径为菌体生长提供大量的前体代谢物，而较高浓度的柠檬酸钠提高了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力，从而提高了HMP途径的通量，为维生素B12的合成提供了大量的NADPH，故维生素B12产量大幅度增加。此外，由于柠檬酸钠与葡萄糖的联合作用增加了细胞内磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的浓度，而PEP是磷酸果糖激酶的强烈抑制剂，而磷酸果糖激酶的活力受高浓度ATP的抑制，柠檬酸钠增强了ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用，因此减缓了糖酵解途径的速率。TCA循环中，柠檬酸合成酶的活力也受到了一定的限制作用。由此可见，柠檬酸钠的添加可增加P.denitrificans中HMP途径的代谢通量，而这可为维生素B12的合成提供充足的还原力NADPH，从而有利于维生素B12发酵产量的提高。
综上所述，柠檬酸钠的添加提高了胞内ATP的含量，增加了HMP途径的代谢通量，降低了EMP和TCA循环的代谢流量，为维生素B12的合成提供充足的还原力NADPH，有利于维生素B12产量的提高。
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