不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响——材料与方法
1、材料与方法
1.1材料与仪器
1.1.1菌种脱氮假单胞杆菌(Pseudomonasdenitrificans)，由本实验室保存。
1.1.2药品和仪器乙酰辅酶A、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶和L-乳酸脱氢酶均为Sigma产品，DNA酶、草酰乙酸、磷酸烯醇丙酮酸、ATP、ADP、NADP、NADH、NADPH均为进口分装生化试剂，其他试剂均为国产分析纯。
UV765型紫外-可见分光光度计；ZHWY-2112型大振幅恒温双层摇床；高效液相色谱仪SPD-20A(MODEL)；雷磁pHS-3C pH计。
1.2培养基
1.2.1斜面培养基蔗糖30 g，蛋白胨10 g，玉米浆10 g，(NH4)2SO40.25 g，(NH4)2HPO41.5 g，MnSO4·H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 0.1 g，琼脂20 g，去离子水1 000 mL。灭菌前调pH至7.0～7.2。
1.2.2种子培养基蔗糖35 g，蛋白胨20 g，KH2PO45 g，(NH4)2SO42.0 g，(NH4)2HPO40.8 g，MgSO41.5 g，ZnSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.2 g，去离子水1 000 mL。灭菌前调pH至7.2～7.4。
1.2.3发酵培养基蔗糖50 g，蛋白胨25 g，(NH4)2SO41 g，ZnSO4·7H2O 0.08 g，MgSO42 g，KH2PO40.8 g，甜菜碱10 g，5，6-二甲基苯并咪唑(DMBI)0.08 g，CoCl2·6H2O 0.15 g，CaCO32 g，去离子水1 000 mL。灭菌前调pH至7.2～7.4。
1.3摇瓶发酵方法
种子液的制备：每支培养好的脱氮假单胞杆菌新鲜斜面(18 mm×180 mm)加入10 mL无菌水，刮洗制备成菌悬液。以无菌吸管吸取2 mL菌悬液至装有种子培养基的三角瓶(装量为50 mL/250 mL三角瓶)中，在摇床上进行种子液的培养，培养条件为：温度30℃；转速180 r/min；培养至OD700为9～10(周期大概24 h)。
摇瓶发酵：培养好的种子液按10%接种量接种到装有发酵培养基的摇瓶(装量为40 mL/250 mL三角瓶)中，在30℃的温度和180 r/min的转速下培养。
将柠檬酸钠按照相应的浓度梯度(浓度梯度为0%、0.05%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%)添加到发酵培养基中，进行摇瓶发酵培养。
1.4酶液的制备
取5 mL发酵液于4℃，4 000 r/min离心20 min，沉淀用5 mL磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7.0)充分混匀后在上述相同条件下离心，弃上清继续用PBS清洗再离心。上述处理后的沉淀中加入5 mL PBS，DNA酶(2.5 mg/mL)25μL，溶菌酶(25 mg/mL)300μL，充分混匀在30℃水浴振荡30 min，于4℃8 000 r/min离心20 min，上清即为细胞裂解液。
1.5测定方法
1.5.1菌体生物量的测定
将取样的发酵液进行适当的稀释后，于700 nm处测定吸光值，用蒸馏水作为对照，试验设3次重复。菌体的光密度(OD700)=OD读数×稀释倍数。
1.5.2维生素B12含量的测定
取30 mL充分摇匀的发酵液于4 000 r/min离心10 min，去上清后加30 mL蒸馏水搅匀在上述相同条件下离心，倒去上清液后加入10 mL蒸馏水将菌体搅匀，加入8%(质量比)亚硝酸钠溶液和冰乙酸各3 mL，摇匀，于95～100℃水浴30 min；水浴后冷却至室温，加蒸馏水定容至50 mL，过滤。所得滤液适当稀释后，在波长为361 nm处进行紫外光谱分析，根据所绘制的标准曲线算出维生素B12含量，试验设3次重复。
1.5.3酶液中蛋白的测定酶液中蛋白的测定采用考马斯亮蓝法。
1.5.4酶活的测定
(1)葡萄糖激酶：采用6-磷酸葡萄糖脱氢酶偶联比色法，1 mL反应体积中含有50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)，1 mmol/L ATP，0.5 mmol/L NADP，10 mmol/L MgCl2，10 mmol/L葡萄糖和0.7U葡萄糖-6-磷酸脱氢酶。
(2)丙酮酸激酶：1 mL反应体积中含有2 mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，5 mmol/L ADP，2 mmol/L果糖-1，6-二磷酸，0.15 mmol/L NADH，80 mmol/L KCl，10 mmol/L MgCl2和2.85 U L-乳酸脱氢酶。
(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶：1 mL反应体积中含有2 mmol/L葡萄糖-6-磷酸，1 mmol/L NADP和10 mmol/L MgCl2。
(4)磷酸果糖激酶：采用酶偶联法，1 mL反应体积中含有2 mmol/L果糖-6-磷酸，1 mmol/L ATP，0.3 mmol/L NADH，10 mmol/L MgCl2，1 U醛缩酶，3.5 U磷酸丙糖异构酶和1 U甘油醛-3-磷酸脱氢酶。
(5)柠檬酸合成酶：1 mL反应体积中含有1 mmol/L 2-硝基苯甲酸(DTNB)，0.5 mmol/L乙酰辅酶A，10 mmol/L草酰乙酸和10 mmol/L MgCl2。
葡萄糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的酶活测定时，1 mL反应体系和50μL细胞裂解液分别在30℃水浴锅中预热5 min，混合后立即连续测定340 nm处吸光值10 min，△A值=反应10 minA340值-反应0 minA340值，根据所绘制的NADPH标准曲线算出酶量。
丙酮酸激酶和磷酸果糖激酶的酶活测定时，1 mL反应体系和50μL细胞裂解液分别在30℃水浴锅中预热5 min，混合后立即连续测定340 nm处吸光值10 min，△A值=反应0 minA340值-反应10 minA340值，根据所绘制的NADH标准曲线算出酶量。
柠檬酸合成酶的酶活测定时，1 mL反应体系和50μL细胞裂解液分别在30℃水浴锅中预热5 min，混合后立即连续测定412 nm处吸光值10 min，△A值=反应10 minA340值-反应0 minA340值，根据公式A=εbc算出酶量，摩尔吸光系数ε=1 485 L/(mol·cm)。
一个酶活力单位(U)定义为在30℃下，1分钟催化1μmol的底物反应所需的酶量。根据各样品的蛋白质含量，计算出酶的比活力(比活力代表的是添加柠檬酸钠与不添加柠檬酸钠对照酶活下的比值)。
1.5.5有机酸的测定采用HPLC法，色谱条件：色谱柱Hi-Plex H(8μm，300 mm×7.8 mm)，流动相0.01 M H2SO4，流速0.4 mL/min，样品量10μL，温度50℃，检测器UV 210 nm。标准品为柠檬酸、延胡索酸、乙酸、丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、草酰乙酸、α-酮戊二酸和丙酸。
不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响——摘要、结论与讨论
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不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响——结果与分析
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