基于食淀粉乳杆菌的生长曲线制备菌株胞外囊泡，且不破坏囊泡结构
目前，对食淀粉乳杆菌胞外囊泡及其提取方法的研究和开发尚处于空白阶段。如何获得一种高效、高纯度、低成本的食淀粉乳杆菌胞外囊泡制备方法且在制备过程中不破坏囊泡结构是目前急需解决的。
为了克服现有技术中存在的至少一个问题，从低成本、高效、高纯度等方面出发综合优化，以食淀粉乳杆菌的生长曲线为切入点，以特定培养时间扩大菌体产量，结合超滤法滤过小分子蛋白等杂质，再以超速离心法分离出胞外囊泡，从而获得高浓度的菌源胞外囊泡。下面提供了一种高效、高纯度、低成本地快速提取食淀粉乳杆菌胞外囊泡(LaEVs)且不会破坏囊泡结构的方法，且证明由食淀粉乳杆菌分泌的胞外囊泡具有效浓度，且形态结构完好无损。
为实现上述目的，建议采用如下技术方案：
一种食淀粉乳杆菌胞外囊泡的制备步骤：
1、接种食淀粉乳杆菌进行培养，获得含胞外囊泡的发酵菌液；
复苏菌种后，挑取菌种于培养基中，放置于恒温培养箱37℃培养4～8h后，以1～4wt％的接种量接种于1～3L培养基中37℃培养12～24h。优选，复苏菌种后，挑取菌种于MRS肉汤，放置于恒温培养箱37℃培养6h后，以2wt％接种量接种于2L的MRS肉汤37℃培养18h，当其他条件保持一致，若降低发酵液体积，则胞外囊泡的产量会降低。上述步骤中，接种量与培养时间结合食淀粉乳杆菌的生长曲线，从而确定：2wt％为最佳接种量，6h为生长期对数前期，18h为生长期对数后期，按此步骤与条件培养，食淀粉乳杆菌的菌体活性与浓度较高，可最大程度提升其分泌的胞外囊泡产量。
2、将获得的发酵菌液离心，去除菌体沉淀，将收集的上清液过滤，收集滤液；
具体包括：将发酵菌液以4000～6000g、4℃离心10～20分钟，弃去菌体沉淀，将收集的上清液使用0.2～0.3μm过滤器过滤，收集滤液。优选，将发酵菌液以5000g、4℃离心15分钟，弃去菌体沉淀，此时所得上清液体积高，保证了胞外囊泡的高产量；将收集的上清液使用0.22μm过滤器过滤，收集滤液，此过滤步骤进一步去除菌体沉淀与相似质量的物质，有利于可提升超滤效率，降低滤膜堵塞造成的损耗。
3、将获得的滤液使用高级离心管离心，收集超滤液；
具体包括：将滤液使用超滤管4000～6000g、4℃离心15～60分钟，收集超滤液。优选，将滤液使用超滤管5000g，4℃离心30分钟。
超滤管含有可截留大于100kDa囊泡的超滤膜。此时超滤膜可截留大于100kDa的囊泡于超滤液中，小于100kDa的物质例如小型肽、寡核苷酸、核酸、酶等其他相似大分子将被除去，经过超滤步骤，可有效提升制备纯度。
超滤管包括滤液接收器，滤液接收器内置样本池，样本池内固定封装膜(超滤膜)，滤液接收器的顶部与样本池盖进行可拆卸连接。
超滤管为高级离心管。可理解的是，超滤管的型号及其过滤器的容积均可根据具体需要选择。在一具体实施方式中，超滤管的过滤器的容积为15mL。利用超滤管浓缩含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡的离心力可为5000g。利用超滤管浓缩含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡的离心时间可为15-60分钟。利用超滤管浓缩含有胞外囊泡的液体中的胞外囊泡在4℃下进行。
4、将获得的超滤液超速离心，将得到的沉淀重悬、过滤，获得食淀粉乳杆菌胞外囊泡。
具体包括：将超滤液以11000～160000g、4℃超速离心1～3小时；将得到的沉淀用PBS重悬，使用0.2～0.3μm过滤器过滤，获得食淀粉乳杆菌胞外囊泡。优选，将超滤液以160000g，4℃超速离心2小时，此时质量相对较重的胞外囊泡将被沉淀，其他条件保持一致，降低超速离心转速可导致胞外囊泡产量降低；将得到的沉淀用PBS重悬，使用0.22μm过滤器过滤，去除上述过程中可能存在的菌体污染，提高分离制备试验的成功率。
食淀粉乳杆菌的分类命名为Lactobacillus amylovorus，其保藏编号为CCTCC NO：M2023427，保藏日期为2023年3月28日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏单位地址为中国，武汉，武汉大学。
本次以食淀粉乳杆菌的生长曲线为切入点，以特定培养时间扩大菌体产量，结合超滤法滤过小分子蛋白等杂质，再以超速离心法分离出胞外囊泡，从而获得高浓度的菌源胞外囊泡，提供了一种高效、高纯度、低成本的胞外囊泡制备方法，且不会破坏囊泡结构。此制备的食淀粉乳杆菌胞外囊泡在疾病治疗、抗菌药物靶点及药物开发、工业发酵乳酸菌调控与动物保健等领域均具有潜在应用价值。
相关新闻推荐
2、不同包装方式下清蒸大黄鱼贮藏过程中PH值、菌落总数、菌群等的变化情况（一）