不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响——结果与分析
2、结果与分析
2.1柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程基本参数的影响
不同浓度的柠檬酸钠对菌体发酵过程基本参数的影响如图1所示。其中A、B、C 3图分别表示菌浓、pH以及维生素B12变化曲线。从图中可以看出，发酵前72 h的菌体生长速度随着柠檬酸钠添加浓度的增大而明显增加，这表明柠檬酸钠的添加有助于P.denitrificans的菌体生长；另外，当发酵培养基中的柠檬酸钠添加浓度为0.3%和0.4%时，其维生素B12发酵产量明显高于未添加柠檬酸钠的发酵处理，产量分别高达45.73μg/mL和50.44μg/mL，这表明柠檬酸钠对产物合成具有一定的促进作用；进一步测定了发酵过程的pH变化情况，结果显示柠檬酸钠有助于维系发酵液的pH保持在合理水平，尽管0.3%和0.4%柠檬酸钠添加方案下的菌体生长较为迅速，但是其整个发酵过程的pH却一直稳定在6.5～7.0，而其他发酵方案的pH出现了明显的下降趋势。
综合以上结果可以得出结论，发酵培养基中添加质量浓度为0.3%～0.4%的柠檬酸钠不仅有利于P.denitrificans的菌体生长和维生素B12合成，而且还对发酵液的pH具有较强的缓冲作用，使得整个发酵过程的pH一值保持在较合理的水平。
图1柠檬酸钠脱氮假单胞杆菌发酵过程基本参数的影响
2.2柠檬酸钠对有机酸代谢的影响
为了进一步研究柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌代谢过程的影响，在发酵培养基中分别加入质量浓度为0%和0.3%的柠檬酸钠，测定这2种发酵方案下有机酸动态变化情况。
由图2可知在脱氮假单胞杆菌发酵过程中，柠檬酸、延胡索酸、琥珀酸和苹果酸是主要的有机酸代谢物。柠檬酸钠的添加明显促进了发酵前期柠檬酸浓度积累。而随着发酵的进行，这2种发酵处理的柠檬酸浓度均呈明显的下降趋势。然而，当培养基中未添加柠檬酸钠时，其柠檬酸浓度反而显著高于0.3%柠檬酸钠添加量下的处理。这说明柠檬酸钠的添加会抑制柠檬酸的生成。在发酵前中期添加柠檬酸钠后，延胡索酸浓度升高，而发酵后期未添加柠檬酸钠的发酵处理略高。因此，柠檬酸钠的添加会促进延胡索酸的生成。但无论是否添加柠檬酸钠，苹果酸浓度在前36 h相差不大，但是此后未添加柠檬酸钠的发酵过程的苹果酸浓度则显著高于0.3%柠檬酸钠添加量的发酵处理，二者含量在72 h时相差达60 mmol/L。这说明柠檬酸钠的添加会促进苹果酸的消耗。在发酵前48 h，未添加柠檬酸钠处理下的琥珀酸浓度明显更高，在发酵后期这2种发酵处理的琥珀酸浓度相差不大。因此，柠檬酸钠的添加会抑制琥珀酸的生成。
2.3柠檬酸钠对糖代谢途径中关键酶活力的影响
以不添加柠檬酸钠的发酵处理为对照，考察了添加0.1%和0.3%2种质量浓度下菌体糖代谢途径中关键酶的相对比酶活力。其结果如图3所示，其中a、b、c、d和e图分别表示葡萄糖激酶、丙酮酸激酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、磷酸果糖激酶和柠檬酸合酶相对比活力。
图2柠檬酸钠对有机酸代谢的影响
图3糖代谢途径关键酶相对比活的时序变化
从图3可以看出，在整个发酵过程中，添加了柠檬酸钠后葡萄糖激酶的活力没有明显的变化，且添加与未添加柠檬酸钠这两者的酶活力相近，比值都在1上下略微波动，始终保持着较大的酶活力，说明柠檬酸钠对葡萄糖激酶的影响不大。在整个发酵过程中，添加了柠檬酸钠后丙酮酸激酶的活力变化很明显。在发酵初期，添加柠檬酸钠后丙酮酸激酶的活力较大，比未添加时增加了35%。随着发酵的进行，其酶活力开始下降，且低于未添加柠檬酸钠时的相对比活力，最低的仅有接近70%，同比发酵初期降低了接近60%。随着葡萄糖的浓度增加，柠檬酸钠开始降低丙酮酸激酶的活力，且较高浓度的柠檬酸钠对丙酮酸激酶的抑制作用更强。
c为0.1%和0.3%2种柠檬酸钠添加质量浓度下，其发酵过程中葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的相对比酶活力时序变化。从图中可看出，添加柠檬酸钠后对葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力有一定的影响，并从图中可以看出，在菌体生长和维生素B12合成的开始阶段，柠檬酸钠提高了葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的活力。从d图不同时间相对酶活数据分析，添加柠檬酸钠后明显降低了磷酸果糖激酶的活性。除此之外，在整个发酵过程中，柠檬酸钠浓度为0.3%的酶活力低于浓度为0.1%的处理，说明柠檬酸钠对磷酸果糖激酶有强烈的抑制作用，且柠檬酸钠的浓度越大，抑制作用越强。与磷酸果糖激酶的酶活力变化趋势相类似，添加柠檬酸钠的柠檬酸合成酶酶活力出现了明显的下降，相对比活最大减少了70%。而且柠檬酸钠的添加浓度越高，其柠檬酸合成酶酶活力越低。由此可见，柠檬酸钠对柠檬酸合成酶的酶活力具有一定的抑制作用，这与前面添加柠檬酸钠会抑制柠檬酸的生成相一致。
不同浓度的柠檬酸钠对脱氮假单胞杆菌发酵过程的影响——摘要、结论与讨论
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