纳米银的制备方法及对小麦赤霉病菌抗菌活性的影响（一）
采用化学还原法制备纳米银，以小麦赤霉病菌为受试菌株，研究纳米银对小麦赤霉病菌抗菌活性、对细胞内3种保护酶：超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化物酶 (POD)、过氧化氢酶 (CAT) 活性和对细胞渗透调节物质：丙二醛 (MDA)、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响。结果表明：纳米银能显著抑制小麦赤霉病菌的生长，抑制作用随着浓度的增加而不断增大，10μg/mL的纳米银对病原菌的抑制率达90%以上，有效中浓度 (50) 为0.59 μg/mL。随着纳米银处理时间 (2、4、6、8和10 h) 的增长，3种酶的活性均出现先增加后降低的变化。SOD、POD和CAT均在4 h出现最高值，10 h降至最低。纳米银使得菌体内丙二醛含量增加，可溶性蛋白和可溶性糖含量降低。纳米银破坏了病原真菌体内细胞的完整性，这可能是纳米银抑制病原菌生长的机理之一。
小麦赤霉病，是由禾谷镰孢菌引起的病害，主要发生在亚洲地区，是小麦生产的重要病害之一。小麦感染赤霉病后，会产生单端孢霉烯真菌毒素，从而导致小麦减产以及品质下降，不适合人类和动物的食用。中国作为世界小麦生产大国，小麦赤霉病发生频率非常高，受小麦赤霉病的影响也很大。纳米银是一种无机抗菌材料，有研究表明，纳米银对细菌、真菌及支原体等致病微生物的生长具有抑制作用，对某些病毒和原生动物也具有很强的杀伤力，同时不产生耐药性，可以作为一种长效且安全性高的抑菌剂。Mishra和Singh研究了纳米银对小麦根腐病菌的抗真菌活性，结果表明纳米银能显著抑制的菌丝生长。0.05 mg/mL的纳米银能明显抑制菌丝生长，0.1 mg/mL的纳米银能完全抑制病原体。Muthuramalingam等研究了胆汁盐修饰的纳米银对炭疽病有很好的抑制效果。此外，纳米银还能够抑制黄瓜和南瓜白粉病 菌、番茄丁香假单胞菌、草莓灰霉病菌、黑曲霉、温特曲霉等病原菌。尽管大量的实验表明，纳米银对细菌和真菌均具有显著的抑制作用，但是纳米银对真菌具体的杀菌过程及机理还不是十分清楚。
生物体内3种重要的保护酶：超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 和过氧化物酶 (POD)，可以防止体内活性氧的产生，清除超氧自由基、H2O2和过氧化物以及降低或抵制羟基自由基的生成等。尹大川等研究了木霉菌株T43及其抑菌活性物质对4种林木病原菌的3种保护酶 (CAT、POD、SOD) 活性的影响，结果发现，菌株T43发酵液乙酸乙酯提取物对病原菌3种保护酶活性均有不同程度的影响，可导致病原菌3种保护酶活性降低，尤其是SOD活性下降得最为显著，从而破坏了细胞的完整性。
可溶性蛋白和可溶性糖作为肌体内的渗透调节物质，当肌体受到外界压迫时，能够降低这种伤害。研究表明，可溶性蛋白和可溶性糖的变化可以反映细胞内蛋白质的合成、变性及降解等。丙二醛 (MDA) 含量变化可以反映膜结构的破坏程度，是反映细胞膜脂质过氧化程度的重要指标。
因此，本试验利用化学还原法制备纳米银，研究纳米银对小麦赤霉病菌的抗菌活性以及对菌体内SOD、POD、CAT三种酶活性和对丙二醛、可溶性蛋白、可溶性糖含量的影响，以此来探讨纳米银的抑菌机理，为纳米银抑菌应用提供理论依据，为解决病原真菌入侵性感染和防治植物真菌病害提供参考。
1 材料与方法
1.1 供试菌株
供试菌株：小麦赤霉病菌，由中北大学微生物实验室提供。
1.2 纳米银的制备
首先将10 mL、0.02 mol/L硝酸银 (AgNO3) 溶液和10 mL、3%聚乙烯吡咯烷酮 (PVP) 溶液混合，然后将该混合液搅拌2 h (室温)，最后在搅拌的同时，逐滴滴加10 mL、0.01%硼氢化钠 (NaBH4) 溶液，制备纳米银溶胶。纳米银溶胶经过离心、去离子水和无水乙醇洗涤数遍、真空干燥得到纳米银粉末。在NaBH4溶液的滴加过程中，反应溶液逐渐变为亮黄色，说明纳米银的形成。采用紫外可见分光光度计表征纳米银溶液的UV-vis吸收光谱，进一步利用透射电子显微镜 (TEM) 表征纳米银的粒径。
1.3 纳米银的抗菌活性
利用生长速率法测定纳米银的抑菌活性。具体方法如下：用马铃薯葡萄糖(PDA)培养基将纳米银稀释成终浓度为10、5、2.5、1.25 μg/mL。取培养5 d的5 mm直径的菌饼，将其轻放于含上述已配制好的不同浓度纳米银的培养基平板中 (有菌丝的一面朝下)。以不添加任何物质的PDA平板作为空白对照，放入28 ℃培养箱中培养，每个处理重复3次。3 d后用十字交叉法测量病原菌的直径，计算菌丝生长抑制率、纳米银浓度的毒力回归方程以及50。
1.4 供试菌的处理
用打孔器取培养5 d、直径5 mm的菌饼，接种到PDA液体培养基中，静置培养8 d，将菌丝体用蒸馏水洗涤3次，用吸水纸吸干，准确称取菌丝0.5 g，分别放入20 mL、10 μg/mL纳米银溶液浸泡2、4、6、8、10 h，过滤菌丝体，用蒸馏水洗涤3次。实验重复3次，测定纳米银对小麦赤霉病菌保护酶活性、MDA含量、可溶性蛋白含量和可溶性糖含量的影响，其中用DDS-11A型电导仪测定电导率，实验以蒸馏水作为对照。
1.5 酶活性测定
SOD酶液制备：往已处理过的菌丝体中加入5 mL、0.05 mol/L磷酸缓冲液 (pH 7.8，含有1% PVP，0.5 mmol/L巯基乙醇和0.1 mmol/LEDTA)，冰浴研磨，于4 ℃、10 000 r/min冷冻离心15 min，得到上清液，置于4 ℃冰箱保存。SOD酶活性采用氮蓝四唑法测定。
POD和CAT酶液的制备：往已处理过的菌丝体中加入5 mL、0.05 mol/L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，含0.1 mmol/LEDTA)，冰浴研磨，4 ℃、10 000 r/min冷冻离心15 min，得到上清液，置于4 ℃冰箱保存。POD酶活性利用愈创木酚法测定。CAT酶活性采用紫外吸收法测定。
1.6 丙二醛 (MDA) 含量的测定
采用硫代巴比妥酸比色法测定小麦赤霉病菌中MDA含量。
1.7 可溶性蛋白含量的测定
可溶性蛋白提取：在1 g已处理过的菌丝体中加10 mL蒸馏水研磨，所得匀浆于12 000 r/min离心15 min，得上清液，定容至10 mL，得粗提液。可溶性蛋白含量采用考马斯亮蓝G-250法测定。
1.8 可溶性糖含量的测定
可溶性糖提取：在1 g已处理过的菌丝体中加入10 mL蒸馏水，沸水浴20 min，冷却过滤定容至25 mL容量瓶中，得粗提液。可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定。
1.9 数据处理与分析
采用SPSS 22.0和OriginProPorable 8.5软件进行数据处理和分析。