肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌的生长抑制效果、对橙汁品质影响——摘要、材料与方法
酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterristris）主要存在于酸性土壤及苹果汁、番茄汁等酸性果汁中，是一种革兰氏阳性细菌，具有嗜酸耐热特性，好氧、无致病性，由该菌污染引起的果汁营养损失、风味劣变、出现沉淀等质量问题已成为制约果蔬加工及出口贸易的瓶颈。据报道，35%的果汁产品变质问题都是因酸土脂环酸芽孢杆菌污染引起的。该菌在不利条件下可形成抗逆性极强的芽孢，条件适宜时芽孢便会萌发生长，产生愈创木酚、2，6-二溴苯酚和2，6-二氯苯酚等代谢产物，散发出难闻气味并引起产品沉淀，是果汁加工行业比较棘手的问题。
作为果汁产业的关键质量因子，关于酸土脂环酸芽孢杆菌的控制研究已有30多年。在已报道的灭菌方法中，物理法控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染的能源及经济消耗较大。高温处理是生产中常用的控制酸土脂环酸芽孢杆菌污染的方法，热处理虽具有杀菌时间短、灭菌效果好的优点，但对果汁的营养成分和感官品质破坏严重。新型灭菌技术中超高压灭菌法对酸土脂环酸芽孢杆菌的杀灭效果较好，能较好地保存果汁产品的营养成分，然而对仪器的要求较高，经济耗费较大。化学法对抑制酸土脂环酸芽孢杆菌也有一定的效果，生产上常用苯甲酸、亚氯酸、次氯酸钠等来抑制酸土脂环酸芽孢杆菌，然而苯甲酸含有刺激性气味，会影响果汁口感，亚氯酸在室温下不稳定，极易分解，在使用过程中对操作技术的要求较高。
随着人们健康意识的增强，具有抑菌性能的天然物质及其衍生物逐渐被开发并应用到食品工业中。有研究报道天然化合物如石榴提取物、葡萄籽提取物、胡椒提取物等对酸土脂环酸芽孢杆菌有一定的抑菌效果，但多数植物提取物含有叶绿素、花色素、黄酮类色素等或者具有不良气味的挥发性气体，而且达到生产要求的抑菌效果的使用剂量较大，往往会影响产品的色泽、口感及风味等感官品质。因此，果汁工业急需开创新型高效的有利于保存果汁营养成分的酸土脂环酸芽孢杆菌控制技术。
肌苷，又称次黄苷，属于人体的正常成分，无色、无味，目前常用于食品加工和制药行业。有研究发现，肌苷可以促进细菌芽孢的复苏，对蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌的芽孢复苏均有促进的效果。然而，课题组在研究肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌芽孢萌发的影响时发现，它不仅不能促进该菌芽孢的萌发，反而能延缓其芽孢萌发并导致萌发后的营养菌体死亡。鉴于酸土脂环酸芽孢杆菌具有独特的嗜酸耐热生理特性，推测肌苷在酸性条件下对该菌可能有特异性抑菌作用。本文通过测定肌苷处理前、后的酸土脂环酸芽孢杆菌生长和生存情况，形态变化及生物膜形成能力来检测肌苷对该菌的抑制效果，研究较好抑菌效果的肌苷添加量对橙汁酸度、糖度、色度及口感的影响，为开发控制酸性果蔬制品中酸土脂环酸芽孢杆菌污染的新型绿色高效抑菌剂提供参考。
1、材料与方法
1.1材料与仪器
酸土脂环酸芽孢杆菌（Alicyclobacillus acidoterristris DSM 3922T），购于德国菌种保藏中心；肌苷、戊二醛、无水乙醇均为分析纯，天津市德恩化学试剂有限公司；橙子为市售鲜果。
ZQTY-70F全温振荡培养箱；TGL-16B台式高速离心机；ES-315全自动高压灭菌器；H1987手持糖度折光仪；CR400便携式色差仪；环境扫描电子显微镜；Varioskan LUX多功能酶标仪；MJBL80Y21美的榨汁机。
1.2培养基的制备
AAM液体培养基：葡萄糖2.0 g，酵母浸粉2.0 g，氯化钙0.38 g，磷酸二氢钾1.2 g，七水硫酸镁1.0 g，一水硫酸锰0.38 g，硫酸铵0.4 g，加灭菌水定容至1 L，调pH值至4.0，121℃高压灭菌15 min；
AAM固体培养基：在液体培养基的基础上添加1.5%～1.8%的琼脂。
1.3试验方法
1.3.1菌株培养条件
将冷冻保藏的酸土脂环酸芽孢杆菌接种于AAM液体培养基中，在45℃、250 r/min条件下活化培养12 h，然后按1%接种量再转接至AAM培养基中，45℃、250 r/min振荡培养。
1.3.2光密度法测定酸土脂环酸芽孢杆菌生长曲线
将活化12 h的菌液按1%的接种量分别接种于含肌苷浓度为0，1，5，10，20，30 mmol/L的AAM液体培养基中，45℃、250 r/min振荡培养24 h，每2 h测定一次菌液吸光值（OD600nm）。以时间为横坐标，吸光值为纵坐标，制作不同浓度肌苷处理下酸土脂环酸芽孢杆菌的生长曲线。
1.3.3结晶紫染色法测定生物膜形成量
采用的96孔板定量法，取20μL 106CFU/mL菌悬液置于96孔板中，每孔分别加入200μL含0，1，5，10，20，30 mmol/L肌苷浓度的AAM培养液。然后将96孔板置于45℃培养箱中静置培养24 h，使细菌完全附着在孔板表面。培养结束后，每孔中加入0.01 mol/L的无菌PBS缓冲液清洗3次。待96孔板风干后，加入无水甲醇固定15 min，弃去孔中废液后风干。然后加入1%的结晶紫溶液，置于室温下染色15 min后，用流动去离子水洗去孔板中残余的结晶紫染料后风干，再加入200μL 33%的冰乙酸溶液进行脱色。脱色完成后，用酶标仪测定每孔的OD600nm值，分析生物被膜形成量。
1.3.4环境扫描电子显微镜检测酸土脂环酸芽孢杆菌形态
将活化至对数期的菌液以1%接种量分别加入肌苷浓度为0 mmol/L和5 mmol/L的培养液中，45℃、250 r/min振荡培养，分别取培养6，12，18，24 h的菌液，离心收集菌体，用预冷的无菌水反复清洗3～5次，加入体积分数为2.5%的戊二醛溶液，置于4℃环境下固定2 h以上。将固定好的样品用预冷的无菌水反复清洗后，利用35%，50%，70%，80%，90%和100%体积分数的乙醇进行梯度脱水后再用无水乙醇重悬。取适量菌悬液滴加于玻片上，自然风干后喷金，利用环境扫描电子显微镜观察菌体形态。
1.3.5平板计数法测定
酸土脂环酸芽孢杆菌生存情况将菌体浓度为107CFU/mL的菌液分别接种至含0，1，5，10，20，30 mmol/L浓度肌苷的AAM培养液中，调整该菌液的初始菌浓度分别为105CFU/mL和106CFU/mL，45℃，250 r/min条件下振荡培养72 h。每6 h取100μL菌液梯度稀释后涂布于AAM固体平板上，45℃，倒置培养24 h后进行菌落计数，检测酸土脂环酸芽孢杆菌的存活情况。
1.3.6鲜榨橙汁制备
选取成熟、饱满的新鲜橙子，清洗干净后加入适量纯水，使用榨汁机制汁，用干净的纱布过滤3～4次，90℃，5 min杀菌备用。
1.3.7果汁理化指标测定
在鲜榨橙汁中分别加入终浓度为0，1，5，10，20，30 mmol/L的肌苷，利用pH仪、手持式糖度折光仪、便携式色差仪测定橙汁的酸度、糖度（可溶性固形物含量，TSS）、颜色参数等理化指标。样品总色差计算公式为：
式中L*代表明暗度，a*代表红绿色值，b*代表黄蓝色值。
1.3.8果汁感官评定
对果汁感官鉴定的方法，制订表1中鲜榨橙汁的评分标准，选择10名食品专业的学生分别从气味、色泽、口感、状态4个方面对橙汁进行感官评价，总分为100分。
表1鲜榨橙汁的感官评分标准
1.4数据处理与分析
所有试验重复3次，采用Origin9.0进行绘图，运用SPSS 23软件Duncan进行方差分析（ANOVA）（P<0.05），试验结果以表示。
肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌的生长抑制效果、对橙汁品质影响——摘要、材料与方法
肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌的生长抑制效果、对橙汁品质影响——结果与分析
肌苷对酸土脂环酸芽孢杆菌的生长抑制效果、对橙汁品质影响——讨论与结论