PlcR在炭疽芽胞杆菌A16R中对其生长状态、溶血酶活性及神经磷脂酶活性影响（二）
2结果与分析
2.1 PlcR在炭疽芽胞杆菌的表达
2.1.1重组表达菌株构建
表达质粒pBE2A和测序正确的重组质粒pBE2A-电击转化DH5a，用引物pBE2_F/R进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆提取质粒后电转入SCS110去甲基化，用相同引物进行菌落PCR鉴定，鉴定正确的克隆提取质粒，电转A16R，用相同引物进行菌落PCR鉴定。结果显示重组质粒pBE2A-导入DH5a、SCS110和炭疽芽胞杆菌中A16R中都扩增出特异的条带，证明重组表达载体pBE2A-已成功转入炭疽芽胞杆菌中A16R中。
2.1.2 PlcR蛋白的表达、纯化及抗PlcR多克隆抗体制备
将基因插入到表达载体pET32a中，构建成重组载体pET32a-，转化大肠杆菌DH5a和BL21后，用引物pET_F/R进行菌落PCR鉴定，都扩增出特异明亮的条带，表明表达质粒成功转入到宿主菌DH5a和BL21中。
PlcR在pET32a中表达，融合蛋白大小为51.5 kDa，pET32a-/BL21诱导表达，用His标签抗体进行蛋白印迹，结果显示蛋白条带大小相符，说明PlcR在BL21成功表达(图1)。
图1重组表达载体pET32a-plcR的构建及PlcR蛋白在大肠杆菌中的表达
2.1.3 Western blot确认PlcR在炭疽芽胞杆菌中表达
挑取pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R单菌落，LB培养基中培养13 h后，取菌体1 mL进行SDS-PAGE分析(图2A)，并使用抗PlcR多克隆抗体检测PlcR是否在炭疽芽胞杆菌中A16R中表达。结果显示，pBE2A-/A16R所在的泳道有一条明显的杂交条带，与PlcR大小相符(33.5 kDa)，因而确定PlcR在炭疽芽胞杆菌中A16R中得到表达(图2B)。
图2 PlcR在炭疽芽胞杆菌中A16R中表达
2.2表型分析
2.2.1生长曲线
从0时开始每隔1 h测600值最后绘制生长曲线图(图3)。在13 h时炭疽芽胞杆菌中A16R进入对数末期，并且A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R 3株菌的生长曲线趋势基本相同，差异不太明显。
图3生长曲线
2.2.2溶血验证
用蜡样芽胞杆菌CMCC63301做阳性对照，同时选A16R做阴性对照，检测PlcR蛋白表达对炭疽芽胞杆菌中A16R溶血能力的影响。结果显示：37℃培养过夜后，蜡样芽胞杆菌CMCC63301菌苔周围形成明显的溶血环，A16R、pBE2A/A16R和pBE2A-/A16R均没有明显溶血环形成。这表明导入外源基因后A16R的溶血活性没有恢复(图4A)。
图4重组炭疽芽胞杆菌中溶血酶活性和神经鞘磷脂酶活性检测
2.2.3神经鞘磷脂酶活性验证
用蜡样芽胞杆菌CMCC63301做阳性对照，同时选A16R做阴性对照，检测PlcR蛋白表达对炭疽芽胞杆菌中A16R神经鞘磷脂酶活性的影响，结果显示：37℃培养过夜后，蜡样芽胞杆菌CMCC63301菌苔周围形成很大的神经鞘磷脂酶消化环，A16R、pBE2A/A16R没有明显的神经鞘磷脂酶消化环形成，pBE2A-/A16R菌落周围有明显的神经鞘磷脂酶消化环形成，但没有CMCC63301强。这表明导入外源基因后A16R的神经鞘磷脂酶活性得到恢复(图4B)。
3讨论
在近期对炭疽芽胞杆菌PlcR研究报道中，实验证明导入外源基因能够使炭疽芽胞杆菌中的溶血酶及神经鞘磷脂酶的活性得到恢复。而在本研究中，在导入外源基因后重组菌株pBE2A/A16R恢复了神经鞘磷脂酶活性，而溶血活性没有恢复，这与文献报道的结果并不完全一致。我们猜测基因在炭疽芽胞杆菌中可能具有多种功能，PlcR蛋白单独就能够激活神经鞘磷脂酶活性，而受基因调控的溶血素基因的激活可能需要与其他基因的共同作用。有研究称受基因调控的毒素基因的表达还需要一个小肽PapR的作用，即PlcR的活性依赖于PapR。位于基因下游70 bp，编码一条48个氨基酸的多肽，其功能是细胞与细胞间的信号传递，基因的突变会影响基因的表达，导致溶血素的表达量大量减少，因此，我们推测溶血酶的活性的激活可能需要PlcR与PapR共同作用，但PapR对神经鞘磷脂酶会起到什么样的作用，仍是未知，这需要我们做更进一步的研究。
PlcR不仅能调控其他蛋白其自身的表达也受自身所调控，且N端较为保守，属于DNA结合区域，受PlcR调控基因的启动子区域存在高度保守的回文序列TATGNAN4TNCATA，有报道推测它可能构成了PlcR的识别位点即PlcRbox。众所周知，炭疽芽胞杆菌与蜡样芽胞杆菌在遗传学上有很高的相似性，而且对基因的进化分析表明，蜡样芽胞杆菌、苏云金芽胞杆菌和炭疽芽胞杆菌中的基因起源于共同的祖先，那么在炭疽芽胞杆菌中发生的无义突变是在进化过程中自身选择的原因造成的还是另有他因，尚不明确。本实验探究了外源基因对炭疽芽胞杆菌的功能影响，另一方面，将炭疽芽胞杆菌中突变的基因重新突变回正常基因，进而研究其对炭疽芽胞杆菌中功能的影响同样是我们值得考虑的。
因此，我们将构建PlcRpapR融合蛋白及恢复炭疽芽胞杆菌中突变的基因的功能，来进一步研究PlcR在A16R中的功能。
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