空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是一种革兰氏阴性微需氧细菌，属于弯曲菌属，是一种典型的食源性人畜共患病原菌，被认为是引发细菌性急性腹泻的主要原因。世界卫生组织统计，空肠弯曲菌每年在全球造成3.7万多人死亡，与空肠弯曲菌相关的食物中毒病例在持续上升。除了引发肠胃炎，对于免疫力低下的人群，感染空肠弯曲菌可导致格林-巴利综合征(Guillain-Barre syndrome，GBS)，容易造成呼吸肌麻痹而死亡，进一步的空肠弯曲菌感染后遗症是关节炎、结节性红斑等。禽类是空肠弯曲菌的主要宿主。空肠弯曲菌在肉鸡群中的定植率为30%～90%，在3周龄以上的鸡群中定植率最高。此外，空肠弯曲菌还可能污染生猪肉、牛肉、羊肉、蔬菜、水果、牛奶等。根据最新报道，空肠弯曲菌对氟喹诺酮类药物、四环素、红霉素、庆大霉素等抗生素均具有抗药性，因此世界卫生组织将其列为重要的耐药细菌，为了有效防治空肠弯曲菌的污染和耐药性，开发新型抗菌剂尤为迫切。

噬菌体是一种细菌病毒，它能够通过尾丝蛋白识别细菌表面的特定受体，从而特异性地识别宿主菌，并在其体内复制，最终裂解宿主菌。噬菌体具有显著的特异性、增殖迅速、强大的抗菌能力，而且不会对其他正常菌群产生影响，因此噬菌体已成为一种广受关注的新型抗菌剂。目前弯曲菌噬菌体大多数是从家禽的肠道或排泄物中分离，主要分为3组:Ⅰ组包含极少数具有大基因组的噬菌体(约320～425 kbp)，Ⅱ组基因组大小介于180～190 kbp，Ⅲ组介于130～140 kbp。Ⅲ组噬菌体的裂解能力更强，在防治弯曲菌污染方面具有更大的优势。空肠弯曲菌特异性噬菌体可用于家禽养殖场，以防止或减少弯曲菌在家禽中的定植。CARVALHO等发现空肠弯曲菌噬菌体鸡尾酒通过口服灌胃和饲料给药时，空肠弯曲菌的数量减少约为2 lg CFU/g;LOC CARRILLO等发现与未处理的对照组相比，在噬菌体给药后5 d内，鸟类盲肠内容物中空肠弯曲菌的数量下降0.55 lg CFU/g。目前只有16个弯曲菌噬菌体完成了全基因组测序，对空肠弯曲菌噬菌体进行生物学表征和基因组学分析的研究十分有限，关于空肠弯曲菌噬菌体用于防控家禽生产中弯曲菌污染的专利也很少，因此需要开发更丰富的空肠弯曲菌噬菌体资源，并对其进行表征和测序，是当前弯曲菌噬菌体研究的重点。

本研究从青岛家禽养殖场鸡粪样品中分离一株裂解性的空肠弯曲菌噬菌体，对其进行生物学特性测定、全基因组分析及进化分析等，为空肠弯曲菌噬菌体的研究和应用提供理论基础，为防控空肠弯曲菌污染和耐药性提供参考。

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1菌株

空肠弯曲菌2206(Campylobacterjejuni2206)由青岛润达生物科技有限公司惠赠;空肠弯曲菌CICC 22936(CampylobacterjejuniCICC 22936)、沙门氏菌14028(Salmonella14028)、铜绿假单胞菌PA01(Pseudomonasaeruginosa01)、铜绿假单胞菌PA14(Pseudomonasaeruginosa14)、枯草芽孢杆菌WB800(BacillussubtilisWB800)由本实验室保存并提供。

1.1.2样品来源

鸡粪便样品采自山东省青岛市家禽养殖场。

1.1.3培养基和主要试剂

NZCYM琼脂培养基、NZCYM Broth，上海生工生物公司;哥伦比亚血琼脂基础培养基、脱纤维羊血、MH肉汤，青岛海博生物技术有限公司;0.22μm无菌滤膜，美国Millipore公司。SM缓冲液:NaCl 5.8 g，MgSO4·7H2O 2 g，1 mol/L Tris-HCl(pH 7.5)50 mL，加超纯水定容至1 L。1×PBS缓冲液:KH2PO40.2 g，Na2HPO42.17 g，NaCl 8 g，KCl 0.2 g溶解于1 L水中，调节最终pH值为7.4。

1.1.4仪器与设备

2.5 L MGC微需氧产气包、2.5 L MGC厌氧罐，日本三菱化学株式会社;mLS-3750高温蒸汽灭菌锅，日本SANYO公司;Sigma3K15离心机，上海曦玛离心机有限公司。

1.2空肠弯曲菌的培养及菌液制备

将Campylobacterjejuni2206划线培养于哥伦比亚血平板，放置微需氧产气包于MGC厌氧罐42℃培养36～48 h。无菌接种单菌落至含有20 mL MH肉汤的小锥形瓶，42℃微需氧摇床培养24 h至菌液出现浑浊。

1.3噬菌体的分离纯化

取适量新鲜的鸡粪样品用SM缓冲液浸泡，放置于4℃冰箱静置过夜，使样品中的噬菌体充分溶解到缓冲液中。将混合物在室温下8 000 r/min离心15 min，通过0.22μm无菌滤膜除菌，即为样品滤液。取500μL样品滤液与500μL对数生长期的空肠弯曲菌液混合，静置20 min，使噬菌体吸附到宿主菌上。将1 mL混合液和4 mL的半固体培养基NZCYM混合在一起，将混合液注入NZCYM固体平板，铺双层平板。将其放置在42℃的微需氧环境中培养24 h，观察噬菌斑的生长状况。

挑取单个噬菌斑梯度稀释于SM缓冲液中，铺双层平板，将平板放置在42℃微需氧环境中培养24 h。大约纯化5～6轮，至平板上噬菌斑的形态一致。

1.4噬菌体的电镜形态观察

将10μL噬菌体增殖液滴加到铜网上面，静置15 min，用滤纸吸去剩余噬菌体溶液，接着滴加10μL 2%磷钨酸染料液，继续染色10 min，最后晾干。使用透射电子显微镜，观察噬菌体的形态特征。

1.5噬菌体的生物学性质

1.5.1噬菌体热稳定性测定

将100μL噬菌体液与900μL SM缓冲液混合，将其分别放入30、40、50、60、70、80℃水浴，分别静置30、60 min，采用双层平板法计算噬菌体在各种温度下的效价，各个温度条件采用3组平行测试。

1.5.2噬菌体pH稳定性测定

取100μL噬菌体液与900μL不同pH值(2～13)的PBS缓冲液混合，于42℃水浴加热2 h后，采用双层平板法测定噬菌体在不同pH缓冲液的效价，每个pH做3组平行。

1.5.3噬菌体最佳感染复数测定

感染复数(multiple of infection，MOI)是指在特定时间内可吸附的噬菌体与宿主菌的比值，是表征裂解性噬菌体侵染能力的一个重要指标。取1 mL对数期的空肠弯曲菌菌液(1.0×107CFU/mL)，分别按照0.001、0.010、0.100、1.000、10.000、100.000的感染复数比例加入1 mL稀释不同浓度的噬菌体，在42℃微需氧摇床，120 r/min条件培养6 h。将混合培养物以12 000 r/min离心2 min。取出100μL的上清液，梯度稀释，然后用双层平板法测定噬菌体的效价。做3组平行实验，噬菌体效价最高的一组感染复数即为最佳感染复数。

1.5.4噬菌体一步生长曲线测定

一步生长曲线测定是衡量噬菌体裂解能力的一个重要生物学指标，能够反映噬菌体潜伏期的长短、裂解量大小等特性。取1 mL对数期的空肠弯曲菌菌液，再加入1 mL效价为1.0×105PFU/mL的噬菌体，按照最佳感染复数(MOI=0.01)，将混合液放入42℃微需氧厌氧罐中，120 r/min孵育20 min，使噬菌体充分吸附到宿主菌上。将混合物离心2 min，弃去上清液，用MH肉汤洗涤2次，将沉淀用MH肉汤重悬加入20 mL MH肉汤中，在42℃的微需氧摇床中以120 r/min的速度进行培养。定时取样，直至300 min。每30 min取样1次测定效价，重复3次实验。以时间为横坐标，以噬菌体效价的对数值为纵坐标，绘制一步生长曲线。

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