Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白单独及联合暴露对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的毒性作用（一）
重金属污染一直受到国际、国内社会的高度关注。重金属沿着食物链，通过生物积累对生物体造成严重的健康威胁。我国南方地区有色金属开采和冶炼活动的快速扩张导致镉、铜及其他金属污染严重，其中稻田镉污染导致稻米中镉含量超过食品安全标准限值。不同重金属种类、有效性、存在形态及含量对生物体产生的毒害效果不同。大多数金属阳离子会与蛋白质有效络合，从而形成不同的金属离子-有机络合物，而目前有关金属和其他物质联合暴露对生物体的毒性研究较为匮乏。因此探究重金属与其他物质联合暴露对生物体的毒性，可以更好地了解重金属对生物体的毒性行为。
苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一种革兰氏阳性芽孢杆菌，其分泌的结晶蛋白（如Cry1Ab和Cry1Ac）可通过复杂的毒性机制控制鳞翅目昆虫。Bt转基因作物被大规模商业化推广种植，从而导致大量Bt毒素蛋白通过植物根系分泌、秸秆还田和花粉飘落的方式进入土壤和水生生态系统，Bt蛋白进入土壤初期会对土壤酶活性产生影响。研究表明Bt毒素进入土壤环境后会与其他污染物，如杀虫剂、抗生素、重金属等相互结合。Bt蛋白因富含酸性氨基酸结构而具有较强的金属络合能力，其倾向与过渡金属离子形成复合物，目前关于Bt抗虫蛋白和重金属联合暴露对微生物的毒理作用研究较少。因此，评估两者联合暴露对微生物活性的影响具有重要意义。
本研究以Cry1Ac蛋白作为Bt蛋白代表，以Zn2+、Cd2+作为重金属代表，以大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为受试模式生物，分析Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白单独及联合暴露对两种细菌的毒性作用，以期为重金属与Bt毒素联合暴露对微生物的生态安全风险进行有效评估。
1材料与方法
1.1菌种及培养基配制
1.1.1菌种来源
大肠杆菌（Escherichia coli）和枯草芽孢杆菌（Ba⁃cillus subtilis）由湖南农业大学微生物实验室提供；发光细菌为费氏弧菌（Vibrio fischeri），购自浙江清华长三角研究院。
1.1.2 LB培养基
液体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超纯水1 L、121℃灭菌25 min。
固体培养基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、超纯水1 L、加入1.5%琼脂、121℃灭菌25 min。
1.2实验方法
1.2.1细菌的生长曲线实验
将1 mL不同浓度的Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白单一及复合体系分别与1 mL菌悬液和8 mL液体培养基混合，最终Zn2+浓度为2、4、8、12、16、20μg∙mL-1，Cd2+浓度为2、4、6、8、10μg∙mL-1，Cry1Ac蛋白浓度为0.2、0.8、1、2、4μg∙mL-1，复合体系的浓度配比为1∶1，浓度为0.2、1、2、4μg∙mL-1，培养24 h。不添加Zn2+、Cd2+、Cry1Ac蛋白的对照组加入1 mL蒸馏水。
1.2.2平板计数
在固体LB培养基中分别加入不同浓度的Zn2+、Cd2+及Zn2+-Cry1Ac、Cd2+-Cry1Ac复合体系（Zn2+：4、8、12、16、20μg∙mL-1；Cd2+：2、4、6、8、10μg∙mL-1；复合体系：2、4μg∙mL-1）溶液，将对数期的E.coli和B.subti⁃lis菌液稀释6倍，分别取100μL均匀涂布于各平板上，在37℃恒温培养12 h后进行活菌计数。以不添加Zn2+、Cd2+和Cry1Ac蛋白培养的细菌菌落数作为对照活菌数（CK），用立体计数仪对活菌进行计数，记录各平板上的菌落数，选取菌落数在30~300个之间的平板用于计算，求出同一处理组平板上生长的平均菌落数。由公式（1）计算存活率：1.2.3细菌活性氧测定
按照1.2.2的步骤收集处理后的E.coli和B.subtilis菌液至50 mL离心管，6 000 r∙min-1离心10 min；用pH为7.02的PBS缓冲液洗涤，6 000 r∙min-1离心5 min，涡旋去除残留；取10μL的活性氧（ROS）荧光探针（浓度为10 mol∙L-1的DCFH-DA）工作液染色30 min，避光37℃孵育30 min，每隔10 min轻轻摇动；孵育结束用磷酸盐缓冲液充分洗涤；用酶标仪在发射波长530 nm处检测样品的荧光强度。
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