基于机制的药代动力学/药效学模型预测大肠杆菌和不同环丙沙星浓度的细菌杀灭时间
研究背景：由于过度使用和滥用抗生素而导致的日益严重的抗生素耐药性问题正威胁着我们回到抗生素前时代。在治疗期间对抗现有耐药性和限制耐药性细菌的富集时，必须了解常见耐药性突变与暴露于抗生素时细菌生长和死亡的时间曲线之间的关系。已经针对不同的细菌菌株和抗生素开发了计算机PK/PD模型。但是模型的目标可能不同。例如，一些模型侧重于根据数据评估基于机制的理论，而一些模型更侧重于提高药物开发效率，例如，基于有限的新信息预测未研究的结果或在存在不太敏感的细菌的情况下对不同给药方案的预测。在这项研究中，研究人员进一步开发了Nielsen模型，用于研究暴露于氟喹诺酮的大肠杆菌。氟喹诺酮类药物是一类重要的抗生素，通常用于对抗革兰氏阴性菌感染。环丙沙星是一种氟喹诺酮类药物，通过抑制DNA促旋酶和拓扑异构酶IV发挥作用，从而抑制细胞分裂和细菌死亡。大肠杆菌中导致环丙沙星耐药的常见突变包括gyrA1、gyrA2（DNA促旋酶）、parC中的突变（拓扑异构酶IV）和marR（外排系统AcrAB的阻遏物）。与WT相比，这些突变通常与更高的MIC值相关，并且还可能降低细菌适应度。这些突变如何影响描述PK/PD关系的参数以及因此药物暴露后细菌杀灭的时间过程是令人感兴趣的，因为这些信息可以为未来研究的设计和给药方案的开发提供有价值的信息。本研究的目的是开发一种基于机制的计算机模型，该模型可以描述大肠杆菌MG1655 WT和暴露于环丙沙星的六种同基因突变体的体外时间杀伤实验，并确定可用于在类似环境中简化未来表征的关系.研究了特定突变对描述不同环丙沙星浓度的细菌杀灭时间过程的模型参数的影响，并开发了一个通用的PK/PD模型结构。
丹麦Biosense微生物生长动态监测系统的应用
使用oCelloScope微生物动态监测0.5x MIC下的细胞随时间的变化形态。在预热的MHII肉汤中制备细菌接种物，不同之处在于第二次稀释以1:50进行，以进一步1:2稀释到微量滴定板（带盖的96孔微量滴定板)已经含有100μL MHII和不同浓度的环丙沙星。通过放大最佳聚焦部分并导出到位图来选择具有代表性的丝状图像。
实验结论
开发一种基于机制的计算机模型，该模型可以描述大肠杆菌MG1655 WT和暴露于环丙沙星的六种同基因突变体的体外时间杀伤实验，并确定可用于在类似环境中简化未来表征的关系.研究了特定突变对描述不同环丙沙星浓度的细菌杀灭时间过程的模型参数的影响，并开发了一个通用的PK/PD模型结构。研究发现模型衍生的突变体特异性EC 50估计值与实验确定的MIC高度相关(r 2=0.99)，这意味着突变菌株的体外时间-杀伤曲线可以通过仅基于模型的MIC合理地很好地预测。开发的模型包括易感生长细菌、较不敏感（预先存在的抗性）生长细菌、非易感非生长细菌和非菌落形成非生长细菌。非菌落形成状态可能是由于细丝的形成，需要描述接近MIC的数据。每种菌株具有不同杀灭细菌效力(EC50)的通用模型结构成功地表征了WT和六种大肠杆菌突变体的时间-杀灭曲线。
图1、突变菌株，与LM347相比的相对适应度，并测量了实验中使用的不同大肠杆菌MG1655菌株的MIC，本实验中确定了WT细菌和其中一种突变体的MIC。
图2、用于大肠杆菌MG1655 WT的VPC及其六个充分表征的突变体。(a)模型拟合完整模型和(b)模型拟合EC50/MIC相关模型。每个面板包括所有观察结果(o)，即至少三个不同的实验，所有可检测细菌的稀释度，黑色实线代表模拟中值。灰色虚线下方的观测值是LOD下方的观测值，并绘制为0.15×LOD(1.5)。对最终模型进行了1000次模拟，以构建80%的预测区间，代表估计的和预期的实验变异性。
图3、为环丙沙星和大肠杆菌MG1655 WT以及暴露于环丙沙星的六种充分表征的突变体开发的基于机制的PK/PD模型。S1、易感菌；R1，静息/不敏感，不生长的细菌；Nc1，亚群1的非菌落形成细菌。亚群2代表预先存在的抗性细菌（S2、R2和Nc2）。
图4、由完整模型估计的EC 50与通过宏观稀释实验确定的MIC。对于具有共享E max和k生长参数的最终模型，不同菌株的估计EC 50值与实验测量的MIC高度相关，r 2=0.99。
图5、(a)菌株LM347的荧光激活细胞分选结果，在y轴上具有相对细菌密度，在x轴上对应于颗粒（细菌）的大小的前向散射光高度（FSC-H）。(b)oCelloScope微生物动态监测系统获得的图像显示LM347菌株在0.5倍环丙沙星MIC下24小时内的细胞形态。从图b中可以看出使用oCelloScope在24小时内研究了0.5×MIC下的细胞形态，并观察到更长的大肠杆菌链表明丝状化）。
总结
本研究开发了一个基于机制的药代动力学/药效学（PK/PD）模型，用于预测环丙沙星对大肠杆菌MG1655野生型（WT）及其六个同源突变体的杀伤力。这些突变体包含一到四个与临床耐药性相关的突变。研究的目的是建立一个模型，能够根据体外时间致死实验数据预测抗生素的最佳剂量策略，以提高治疗效果并限制耐药性的产生。研究中WT和突变体暴露于不同浓度的环丙沙星，通过时间杀死实验收集数据。Biosense微生物动态监测系统（oCelloScope）被用于监测和分析大肠杆菌在暴露于环丙沙星后的细胞形态变化。Biosense微生物动态监测系统（oCelloScope）在本研究中作为一种重要的实验工具，提供了关于细菌形态变化的直观证据，这些证据对于理解细菌对抗生素的响应、构建和验证PK/PD模型以及预测抗生素的杀伤力具有重要作用。建立的模型包括易感生长细菌、较低易感生长细菌、非易感非生长细菌和非形成菌落的非生长细菌。模型成功描述了WT和突变体的时间杀灭曲线，并显示出突变体特异性的EC50（抗生素浓度达到最大杀灭率50%的值）与实验测定的MIC高度相关（r2=0.99），表明可以通过MIC值预测突变体菌株的体外时间杀死曲线。研究结果表明，该模型能够预测不同大肠杆菌菌株的体外时间杀死曲线，对于指导药物研发和优化给药方案具有潜在价值。此外，模型的建立为预测患者群体中的改进剂量策略提供了可能，有助于有效治疗由WT和耐药大肠杆菌引起的感染。研究的局限性包括未涉及传统静态体外时间杀灭条件之外的数据，以及研究的菌株除了耐药性突变外都是同源的，没有包括临床分离的大肠杆菌。未来的研究需要针对不同的大肠杆菌菌株和其他实验条件对模型的预测能力进行评估，以更好地了解其在药物开发中的实用性。
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