猪链球菌对34种常用药物的敏感性检测【药敏实验】
摘要：猪链球菌是一种常见的病原菌，能引起动物和人类发生猪链球菌病，本实验通过在山西灵石某猪场发病猪群中取样，分离病原菌，并且对病原菌进行培养、镜检、生化鉴定以及PCR的技术扩增其gdh和16srRNA的序列，然后进行药敏实验。鉴定出分离菌能够在鲜血平板上形成溶血环、革兰氏染色阳性、43种生化试验结果以及扩增出特异性条带，表明分离到的病原菌为猪链球菌。药敏实验结果可见其对强力霉素等药物敏感，而对头孢曲松和磷霉素完全耐药。为山西地区猪链球菌的防治提供参考。
猪链球菌可引起猪的败血症、脑膜炎、心内膜炎、关节炎等症状。它是世界范围内引发猪链球菌病最主要的病原，目前已确定有35（1～34及1/2）个血清型，不同国家和地区具有不同的流行株，其中2型流行最广、致病性最强。
猪链球菌不断的在各地发生，其对药物的敏感程度也在不断的发生变化，特别是对一些常用药的敏感性降低，甚至出现耐药菌，赵慧梅等对山西地区猪链球菌分离株进行药敏实验可见大多对链霉素和庆大霉素耐药。湖南分离到的猪链球菌对四环素和磺胺甲恶唑耐药率达到100%。
本研究对山西地区分离到的猪链球菌进行药敏实验，通过对34种常用药物的敏感性检测，旨在为山西省筛选药物防治猪链球菌病提供参考。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1病料来源疑似猪链球菌感染的组织器官采集于山西灵石县某猪场。
1.1.2主要试剂血琼脂平板培养基购于郑州安图绿科生物工程有限公司。TSA和TSB培养基购于美国BD公司。新生牛血清购于杭州四季青生物公司。核酸分子量标准物Trans2K plus DNA Marker购自北京东盛生物有限公司。细菌全基因组快速提取试剂盒购自北京捷瑞生物有限公司。链球菌参考血清购自丹麦皇家血清研究所（Statens Seruminstitut，Copenhagen，Denmar k），引物是由上海生工有限公司合成。测序由上海生工有限公司完成。生化鉴定由山西医学科学院山西大医院检验科完成。
1.1.3药敏纸片药敏纸片购于北京天坛药物生物技术开发公司，共34种，药物如下：青霉素、氨苄西林、链霉素、庆大霉素、硫酸新霉素、卡那霉素、红霉素、阿奇霉素、头孢噻吩、头孢拉定、头孢唑啉、氧氟沙星、诺氟沙星、强力霉素、环丙沙星、头孢曲松、盐酸林可霉素、盐酸恩诺沙星、阿米卡星、磷霉素、磺胺嘧啶钠、头孢哌酮、头孢呋辛钠、头孢吡肟、头孢噻肟、头孢他啶、苯唑西林、乙酰螺旋霉素、磺胺氯吡嗪钠、硫酸粘杆菌素、盐酸沙拉沙星、硫酸安普霉素、盐酸林可霉素、盐酸土霉素。
1.2方法
1.2.1病原的分离培养无菌收集发病猪的关节液，肝脏，心脏，脾脏等器官，将采集的病料划线接种于添加有5%新生牛血清的TSA培养基，37℃24 h后挑取针尖大小、灰白色、呈圆形、表面光滑、边缘整齐的菌落纯培养接种于鲜血琼脂平板。
1.2.2镜检对可见溶血环的疑似菌落进行革兰氏染色，结晶紫1 min，碘液1 min，酒精脱色30 s，复红50 s，油镜下镜检观察。
1.2.3生化鉴定挑取TSA培养基上纯培养的单个菌落接种于TSB中，37℃静置培养24 h后的菌液送检。
1.2.4细菌DNA提取及PCR扩增对病原菌使用细菌全基因组快速提取试剂盒，镜检呈阳性，生化鉴定为链球菌，提取全基因组。具体步骤为：挑取TSA复苏的单菌落，在含5%新生牛血清的TSB培养基中培养约10 h，取2 mL菌液4 000 rpm离心5 min以收集菌液，将菌沉淀重悬，加10μL 10 mg/mL溶菌酶溶液，充分混匀后于37℃静置30 min以上，以破除细胞壁。破壁后加入混有SDS的15 mg/mL蛋白酶K 30μL，于55℃水浴2 h，加等量酚∶氯仿∶异戊醇（25∶24∶1），8 000 rpm离心10 min。此时吸取上层清液于另一EP管中，于其中加异丙醇使DNA完全沉淀，8 000 rpm离心5 min取沉淀。使用冷乙醇洗涤沉淀，同上步离心弃上清液，向沉淀中加DNA洗脱液静置充分溶解DNA，4℃保存备用。以提取出来的基因组为模板，对分离菌的gdh基因和16SrRNA序列扩增的方法进行分子鉴定，使用华中农业大学农业微生物重点实验室设计的引物扩增。
1.2.5药敏实验采用K-B纸片扩散法，挑取猪链球菌单个菌落密集均匀地涂布整个平板，将含有抗生素药物的滤纸片用烧灼灭菌的镊子分别贴于平板表面，相互间应间隔一定距离，37℃培养24 h后，观察结果。判定标准：应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
2结果
2.1病原分离培养结果
从发病猪内脏器官和关节等部位分离到的病原菌在鲜血琼脂培养基上生长良好，菌落周围有透明溶血环。
2.2病原菌镜检结果
病原菌革兰氏染色镜检为G+，染成紫色的球菌呈单个、两个相连或连接呈现短链状（见图1）。
2.3生化鉴定结果
经43种生化试验，分离菌株符合猪链球菌的生化培养特性，鉴定为猪链球菌（见表2）。
2.4 PCR扩增结果
扩增猪链球菌的gdh基因后得到566 bp的条带。16srRNA基因扩增可见有1411 bp的条带。
2.5药敏试验结果
用34种药物对分离到的猪链球菌进行药敏实验，结果见表3。
由表可见，猪链球菌分离株对强力霉素、卡那霉素等药物敏感，而对头孢曲松和磷霉素完全耐药。
3讨论
猪链球菌的鉴定一般采用培养特性及生化实验，溶血实验等，也有用PCR的方法扩增其gdh基因和16srRNA基因序列的并将其扩增测序以及同源性比对。还有人通过扩增其cps和epf基因来鉴定猪链球菌。本实验结合传统生长生化实验，溶血实验与PCR扩增其gdh基因和16srRNA基因的方法来鉴定猪链球菌尚属国内首例。
由于药物的不合理使用，导致猪链球菌耐药株的出现，各地均出现了不同药物的耐药株，常见药物对猪链球菌2型的敏感性呈现下降趋势，耐药普扩大。本实验的结果却是对生产中较为常用的强力霉素、卡那霉素、红霉素及环丙沙星等药物均敏感，而对头孢曲松和磷霉素出现耐药性。这可能与养殖场管理人员的思维定势有关，认为常用抗生素使用过频，耐药性肯定会严重，转而使用生产中不常用的头孢曲松和磷霉素，造成链球菌对这两种药物产生耐药性，导致防治不力。因此在生产用药中应该做到轮换用药和联合用药，降低病原菌产生耐药性的速度。
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