枯草芽孢杆菌BC80-6发酵培养基、生长条件及对烟草根黑腐病菌生防作用（一）
枯草芽孢杆菌是一类好氧性革兰氏阳性细菌。在自然界分布广泛，对环境友好，是土壤和植物微生态中的优势微生物种群。枯草芽孢杆菌抗逆性较强，具有很好的抗菌防病作用，可防治多种植物病害。枯草芽孢杆菌BS916可以在番茄根部有效定殖，是其在田间防治番茄青枯病的重要保障。利用枯草芽孢杆菌XF-1来抑制白菜根肿病菌的侵染和繁殖。枯草芽孢杆菌G3不仅能较好的防治菜豆和茄子苗期的炭疽病和菌核病，同时还能防治番茄的叶霉病，防效达78.8%。黎起秦等发现内生枯草芽孢杆菌B47对番茄青枯病的防效可达79.79%。利用内生枯草芽孢杆菌T295较好的控制了烟草根黑腐病的发生。由于枯草芽孢杆菌具有稳定的定殖能力和适应能力，使其具有巨大生存空间的竞争优势，从而能有效发挥其抗菌防病作用。但由于在引入新拮抗枯草芽孢杆菌时，需要打破原来的生态平衡，且拮抗枯草芽孢杆菌的定殖较为复杂和困难，这就使很多拮抗菌的生防效果不稳定。
枯草芽孢杆菌BC80-6（Bacillus subtilis，BC80-6）是低能离子束注入诱变获得的拮抗菌，具有较强的广谱性，对烟草根黑腐病菌（Thielaviopsis basicola）具有一定的生防作用。为此，探究了3种BC80-6菌株处理液对烟草根黑腐病菌菌丝生长、孢子萌发的抑制作用，再以菌株BC80-6活菌含量为指标，优化菌株BC80-6的发酵培养基成分和发酵条件，并开展田间控病防效试验，旨在为建立烟草根黑腐病的绿色防控体系提供依据。
1、材料与方法
1.1、材料和试剂
1.1.1材料
烤烟品种为云烟97，由安徽省农业科学院烟草研究所提供。枯草芽孢杆菌BC80-6（Bacillus subtilis，BC80-6）和烟草根黑腐病菌[Thielaviopsis basicola（Berk.et br.）Fer.]均由安徽农业大学植物保护学院病理研究室分离、鉴定与保存。
1.1.2试剂
葡萄糖、乳糖、淀粉、甘油、麦芽糖、酵母浸出物、牛肉膏、尿素、氯化铵、大豆蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖、琼脂粉、NaCl、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、CaCl2、FeSO4、MnCl2（合肥沐辰生物技术有限公司），70%甲基托布津可湿性粉剂（河北冠龙农化有限公司），80%多菌灵可湿性粉剂（江苏泰仓农化有限公司）。
1.2、方法
1.2.1培养液制备
将枯草芽孢杆菌BC80-6在NA培养基上活化48 h后，接入50 mL的NB培养液中，28℃、180 r/min振荡培养72 h，进行活菌液、过滤液和高温灭菌液的制备。①活菌液：将培养液4 000 r/min离心15 min后弃上清液，沉淀中加入无菌水混匀后，4 000 r/min离心15 min后弃上清液，重复上述步骤1次，获得浓度为1×108 cfu/mL的活菌液。②过滤液：将培养液先用0.22μm的微孔滤膜过滤，将过滤后的溶液8 000 r/min离心30 min，离心后获得的上清液即为过滤液。③高温灭菌液：将过滤液经121℃灭菌20 min，获得高温灭菌液。
NA培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，琼脂粉20 g，水1 L。
NB培养基：牛肉浸膏3 g，蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，水1 L。
1.2.2生长抑制率的测定
病原菌菌碟的制备：挑取一小块病原菌接入PDA平板中，在25℃恒温培养箱中培养5 d。用直径为4 mm的打孔器沿菌落边缘打取菌碟，将菌碟接入PDA平板中央，25℃培养9 d，再用直径为4 mm的打孔器沿菌落边缘打取菌碟，备用。
将活菌液、过滤液、高温灭菌液分别按1:10、1:100、1:500进行稀释，制备成3种PDA培养基。在3种培养基中分别接入病原菌菌碟，置于25℃恒温培养箱中培养，每隔3 d观察一次。不加任何处理液的培养基为对照，每个处理重复3次。9 d后用十字交叉法测量菌落直径，计算不同培养液对菌丝生长的抑制率。
菌丝生长抑制率=（对照组菌落平均直径-处理组菌落平均直径）/对照组菌落平均直径×100%
1.2.3孢子萌发抑制率的测定
将烟草根黑腐病病原菌接入PDA平板中，在25℃恒温培养箱中培养9 d后，配制孢子悬浮液（浓度为2×105个/mL）。将活菌液、过滤液、高温灭菌液分别按1:20、1:200、1:1 000进行稀释，再分别与孢子悬浮液按1:1的比例进行混合。取150μL的混合液滴于凹玻片中，置于培养皿内保湿，25℃恒温培养箱中培养。无菌水处理为对照，每个处理重复3次。6 h后观察孢子的萌发情况，每个处理镜检300个孢子，并计算不同处理液浓度对烟草根黑腐病菌分生孢子萌发的抑制率。
孢子萌发抑制率=（对照组孢子萌发平均数-处理组孢子萌发平均数）/对照组孢子萌发平均数×100%
1.2.4培养基成分的优化
种子液的配制。将枯草芽孢杆菌BC80-6接种在NA培养基上培养48 h后，用接种环蘸取活化后的菌种，接入装有25 mL种子培养基（蛋白胨10 g，酵母浸出物5 g，氯化钠10 g，水1 L，pH 7.0）的三角瓶中，28℃、180 r/min黑暗振荡培养36 h。
碳源的优化。分别用1%葡萄糖、1%乳糖、1%淀粉、1%甘油和1%麦芽糖（W/V）等量替代基础发酵培养基中的蔗糖，制成不同碳源培养基。基础发酵培养基（蔗糖10 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，水1 L，pH 7.0）为对照。按5%的接种量分别接入装有25 mL不同碳源培养基的培养瓶中，160 r/min、28℃下黑暗振荡培养。24 h后测定不同碳源培养基中活菌含量（活菌含量即1 mL培养基中所含枯草芽孢杆菌的数量，cfu/mL），每个处理重复3次。根据不同碳源培养基中的活菌含量确定最佳碳源。
氮源的优化。分别用1%酵母浸出物、1%牛肉膏、1%尿素、1%氯化铵、1%大豆蛋白胨（质量体积比）替代基础发酵培养基中的蛋白胨，以基础发酵培养基为对照。按5%的接种量接入分别装有25 mL不同氮源培养基的培养瓶中，160 r/min、28℃条件下黑暗振荡培养，24 h后测定不同氮源培养基中的活菌含量，每个处理重复3次。根据不同氮源培养基中的活菌含量确定最佳氮源。
无机盐的优化。根据微生物对大量元素与微量元素不同的利用情况，在不同基础发酵培养基中分别加入0.5%NaCl、0.5%K2HPO4、0.5%NaH2PO4、0.05%MgSO4、0.05%CaCl2、0.005‰FeSO4、0.005‰MnCl2（质量体积比），基础发酵培养基为对照。按5%的接种量接入装有25 mL不同无机盐培养基的培养瓶中，160 r/min、28℃条件下黑暗振荡培养，24 h后测定不同无机盐培养基中的活菌含量，每个处理重复3次。根据不同无机盐培养基中的活菌含量确定最佳无机盐种类。
通过氮源、碳源、无机盐3个单因素试验，筛选出最佳氮源、碳源、无机盐的种类。设置最佳氮源含量（A）、最佳碳源含量（B）、最佳无机盐含量（C）3个因素处理，每个因素分别设置3个水平，按L9（33）正交设计进行试验。
1.2.5发酵条件的优化
生长曲线的测定。将活化的枯草芽孢杆菌BC80-6接入1.2.4节中确定的最优培养基中，25℃发酵培养，每3 h取1次菌液，测定菌液OD600，共培养48 h。未接菌的培养基为空白对照。以时间为横坐标，菌体OD600为纵坐标，绘制枯草芽孢杆菌的生长曲线。
培养温度的优化。摇床温度设定为25、28、30、33、35、37、40℃，将BC80-6接到50 mL优化后的培养基中，摇瓶培养24 h后，测定活菌含量并绘制图表。
培养液初始pH值的优化。优化培养基的初始pH设为5.5、6.0、6.5、7.0、7.2、7.5、8.0，将BC80-6接入不同pH、50 mL优化后的培养基中，在最适生长温度下培养24 h后，测定活菌含量并绘制图表。
接种量的优化。按1%、3%、5%、7%、9%（体积比）的接种量将BC80-6分别接入到50 mL优化后的培养基中，在最适生长温度下培养24 h后，测定活菌含量并绘制图表。
转速的优化。摇床转速分别调节为120、140、160、180、200、220 r/min，将BC80-6接入到50 mL优化后的培养基中，在最适生长温度下培养24 h后，测定活菌含量并绘制图表。
装液量的优化。在5个250 mL三角瓶中，分别装入20、40、60、80和100 mL优化后的培养基，按照最适接种量将BC80-6接入到培养基中，在最适生长温度下培养24 h后，测定活菌含量并绘制图表。
1.2.6田间防控效果调查
BC80-6发酵液和病原菌孢子悬浮液的制备。根据摇瓶培养优化的发酵条件，用40 L发酵罐扩大培养BC80-6至菌液浓度为1×108 cfu/mL，用于灌根施药。将烟草根黑腐病原菌接入PDA培养基中，25℃恒温培养9 d。用无菌水冲洗PDA平板上的病原菌，制备浓度为106~107个/mL的孢子悬浮液。
在安徽省宣城市黄渡乡选择土壤肥力较好的地块作为试验田。于2017年3月14日进行大田移栽，烟苗移栽两周后进行接种。用灭菌的剪刀斜切烟草根部造成伤口，取20 mL孢子悬浮液灌于烟株根部。接种后10 d进行灌根施药，每株烟苗200 mL发酵液。同时设70%甲基托布津可湿性粉剂、80%多菌灵可湿性粉剂和清水为对照。每个处理20株烟草，共3次重复，随机区组排列。施药后第20天，按照GB/T 23222—2008进行病害调查及分级，并计算发病率、病情指数及防治效果，用DPS软件对数据进行方差分析。
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