优化培养基配方减少无机硒对粗毛纤孔菌的抑制作用，同时提高富硒菌丝的产量（一）
粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)属于锈革孔菌科(Hymenochaetaceae)纤孔菌属(Inonotus),又名粗毛黄褐孔,是一种珍惜的药用真菌。该菌以寄生为主,主要分布于新疆、宁夏、内蒙古、黑龙江、吉林等北温带地区。该菌在民间作为“桑黄”采集入药,常用于糖尿病、痛风、关节炎等疾病。经国内专家学者对该菌进行考证,发现该菌即为古代中药“桑黄”。此外,大量研究表明该菌具有多种生物活性,如抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、降血脂、活血化瘀、保肝及提高免疫力等作用。目前对该菌的研究主要集中在鉴定、菌种筛选、栽培以及多糖、酚类化合物、三萜等生物活性代谢物及小分子化合物的提取及研究方面。
已有研究表明,食药用菌如平菇、双孢菇、雨伞菇、草菇、榆黄菇、牛肝菌、灵芝等具有转化无机硒并积累有机硒元素的有效机制。理论上野生食药用菌中硒含量应具较高水平,但实际上大多数野生食药用物种都处于硒缺乏状态,每克子实体干重含硒浓度小于1μg。研究表明,食药用菌积累微量营养素的能力受土壤基质、真菌种类和元素类型的影响,且生长基质中硒的浓度也会阻碍食药用菌菌丝的生长和子实体的形成。因此,了解食药用菌对无机硒的耐受度及合理的富硒培养基成分是生产富硒功能性食药用菌的前提条件。现如今,关于粗毛纤孔菌对无机硒的耐受度及富硒培养基成分还鲜有报道。本研究通过响应面法对富硒粗毛纤孔菌菌丝生长培养基成分进行优化,旨在减少无机硒对粗毛纤孔菌的抑制作用,最大程度保证该菌菌丝能够在富硒的同时,正常甚至更好地生长,提高富硒菌丝的产量。
1材料与方法
1.1材料与仪器
粗毛纤孔菌(Inonotushispidus)福建农林大学国家菌草工程技术研究中心提供;亚硒酸钠西亚试剂公司;葡萄糖西陇科学股份有限公司;硫酸镁阿拉丁工业有限公司;磷酸二氢钾西陇科学股份有限公司;VB1山东西亚化学工业有限公司;浓硝酸南京化学试剂股份有限公司;母种培养基为改良PDA培养基:马铃薯200 g/L、葡萄糖30 g/L、硫酸镁0.75 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、维生素B1(VB1)1 mg/L、琼脂15 g/L。
LDZX-50FBS高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械厂;SW-CJ-2A超净工作台苏州佳宝净化工程设备有限公司;HPX-9272MBE电热恒温培养箱上海博迅实业有限公司;X-seriesⅡ电感耦合等离子体质谱仪Thermo股份有限公司。
1.2实验方法
1.2.1母种活化及接种取粗毛纤孔菌斜面母种约0.25 cm2接种于改良PDA平板中,倒置于恒温培养箱30℃暗光培养。待菌丝生长覆盖至平板2/3左右,于菌落边缘取直径为0.6 cm活化菌块作为后续实验母种。
1.2.2单因素实验
1.2.2.1硒浓度对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响以改良PDA培养基为基础,向其中添加1 mg/mL亚硒酸钠溶液,通过梯度稀释法配制硒浓度分别为2.33、4.66、9.31、18.63、37.25、74.5、149、298和596 mg/L的供试培养基,以无硒添加的改良PDA培养基为对照(CK)。将供试培养基注入灭菌(121℃、20 min)后的培养皿,每皿约25 mL,冷却凝固后接入直径为0.6 cm的活化菌块,每个浓度5个重复。30℃暗光倒置培养8 d后,观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,使用游标卡尺利用十字交叉法精确测量菌落生长直径,记录数据。
1.2.2.2常规培养料对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响以改良PDA培养基为基础,分别配制麸皮、玉米粉、大米、豆粉培养基,用以筛选粗毛纤孔菌菌丝最适生长培养料。其中:
麸皮培养基:麸皮50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。
玉米粉培养基:玉米粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。
大米培养基:大米50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。
豆粉培养基:豆粉50 g/L、葡萄糖30 g/L、MgSO40.75 g/L、KH2PO41 g/L、VB11 mg/L、琼脂15 g/L,pH自然。
每种培养基5个重复,30℃暗光倒置培养8 d后观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,测量并记录数据。
1.2.2.3补充碳源对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响以改良PDA培养基为基础,将培养基中的葡萄糖(30 g/L)调整为等量蔗糖、乳糖、果糖或海藻糖,每种培养基5个重复,30℃暗光倒置培养8 d后观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,测量并记录数据。
1.2.2.4培养基pH对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响多数食药用菌适宜在微酸和中性pH条件下生长,因此,以改良PDA培养基为基础,将培养基pH分别调整为5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5,每种培养基5个重复,30℃暗光倒置培养8 d后观察粗毛纤孔菌菌丝生长情况,测量并记录数据。
1.2.3 Box-Behnken design优化粗毛纤孔菌菌丝富硒培养基配方为考察培养基各成分与外源硒对粗毛纤孔菌菌丝生长的影响及其之间的交互效应,以单因素实验结果为依据,以粗毛纤孔菌菌丝生长速度为指标(Y),在最适pH条件下,采用Box-Behnken模型设计三因素、三水平组合实验(表1),对结果进行响应面分析,得到最优响应Y值,从而得到最佳富硒粗毛纤孔菌菌丝培养基配方。
表1 BBD实验因素水平表
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