发根农杆菌Ri质粒构建灯盏花发根最优的培养体系（三）
2.2菌液浓度对发根诱导率的影响
在农杆菌介导的遗传转化中，菌液浓度是否适当是转化成功与否的关键问题之一。若菌液浓度过低，可能会使农杆菌无法有效侵染叶盘而导致转化效率过低；若菌液浓度过高，则可能造成侵染过度或菌体产生代谢物对植物细胞造成伤害而导致叶盘死亡。此外，如果浓度过高，可能使农杆菌在共培养培养基上也会生长过旺，导致后续的脱菌培养无法进行。
试验中发现当菌液浓度的OD600值为0.4时，诱导率普遍较低，甚至未能成功诱导出阳性发根；菌液浓度在OD600值为0.8时虽然转化率较高，但外植体死亡率或染菌率也高，发根后续脱菌培养过程难以抑制农杆菌生长，造成无法液培。而OD600为0.6时，整体上诱导率相对较高，外植体死亡率较低，且基本不影响后续的脱菌培养及液培。因此综合取OD600=0.6为最佳菌液浓度。
2.3浸染时间对发根诱导率的影响
农杆菌菌液浸染叶盘的时间对转化率有很大影响。若浸染时间太短，可能农杆菌未能成功侵入叶盘细胞而导致转化失败；若浸染时间太长，则农杆菌容易对叶盘造成过度伤害而使叶盘黄化死亡。
试验中发现当菌液浓度较低时，浸染时间越长，则整体上诱导率越高，但叶盘死亡率或染菌率也随之增高；菌液浓度较高时，浸染时间在10 min以内，诱导率随浸染时间的增加而整体呈增加的趋势，但浸染时间达15 min时，则因叶盘大量黄化死亡而导致诱导率直线下降。因此，综合取浸染时间为10 min最佳。
2.4共培养时间对发根诱导率的影响
浸染后共培养的目的，是使叶盘表面的农杆菌充分侵入细胞。因此，共培养时间也是影响诱导率的重要因素。试验表明，菌液浓度较低，浸染时间较短时，0～3 d内，共培养时间越长，诱导率基本就越高，但同样存在随共培养时间增加，叶盘死亡率和染菌率也增高的问题；而菌液浓度较高，浸染时间较长时，共培养时间在0～2 d时，诱导率整体呈增长趋势，但超过2 d，则转化率不会再显著升高，甚至反而会因为过度生长的农杆菌抑制植物细胞的正常生长，造成叶盘死亡率急剧升高，或者因脱菌不完全而导致无法液培。因此，共培养时间以2 d为最好。
2.5不同液体培养基对发根生长速率的影响
发根脱菌完全后，转移到液体培养基中进行扩大培养。在上述4种不同的液体培养基中，发根生长速率不同，总体上是B5>1/2MS≈1/2B5>MS。在含200 mL B5液体培养基的250 mL锥形瓶中，发根整个生长周期为60～70 d，其中前3周，发根生长速率极慢，基本看不到明显的生长现象，第4周开始表现出较快的生长速率，在第5～7周生长速率达到最快，在第8～9周以后生长基本进入停滞期，10周之后发根开始变硬，部分根尖开始褐化。不同培养基生长速率比较如图3。
图3发根在不同培养基中生长速率
3结论与讨论
本研究利用发根农杆菌C58C1菌株侵染灯盏花叶片，成功诱导出毛状根。同时，通过对菌液浓度、浸染时间和共培养时间3个影响因素的试验，优化了灯盏花发根的诱导条件。
结果显示农杆菌菌液浓度直接影响发根诱导效率，灯盏花发根诱导的最佳菌液浓度为OD600=0.6，李景滨等的研究发现，金铁锁(Psammosilenetunicoides)毛状根诱导的最佳菌液浓度为OD600=0.8；农杆菌对叶盘的浸染时间是遗传转化中的重要因素，灯盏花最佳浸染时间为10 min，黄伟剑等的研究表明，广藿香(Pogostemoncablin)毛状根诱导的最佳浸染时间为25 min；共培养时间的长短也与转化效率密切相关，适于灯盏花发根诱导的共培养时间为2 d，刘连旺等的研究显示，适于地黄(Rehmanniaglutinosa)毛状根诱导的最佳共培养时间为4 d。由此可见不同植物对农杆菌敏感性不同，因此选择合适的菌液浓度、浸染时间和共培养时间有助于提高诱导率。另外，灯盏花发根扩大培养的最佳培养基为B5液体培养基。
本研究初步建立了灯盏花发根遗传转化体系。随着对植物中次生代谢途径了解的深入，基因克隆和高效遗传转化系统的发展，利用遗传代谢工程手段在植物细胞工厂大量生产有药理活性的次生代谢化合物已成为可能。如果将灯盏花中灯盏乙素代谢途径中催化速率限制步骤的关键酶基因采用代谢工程的方法在灯盏花植物体或发根中过量表达，则理论上也可以提高灯盏乙素的含量。
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