不同涂布方法与平板放置时间对乳酸菌的平板菌落计数法的影响
【摘要】目的研究不同涂布方法与平板放置时间对于平板菌落计数法的影响，为微生物计数研究提供基础理论依据。方法分别比较圆形、井字、先圆形后井字和90°转动平板横线涂布方法以及平板放置3、6、9 h和12 h对于副干酪乳杆菌在乳酸细菌培养基（MRS）平板菌落计数的影响，并做分析。结果不同涂布方法对于活菌数的影响不明显，而对于同一涂法方法来说，平板放置12 h后，微生物生长的菌落数最低。不同涂布方法相对标准偏差均大约在10%以内。结论在涂布平板做乳酸菌菌落计数时，同一稀释度下，无论以何种涂布方式，将菌液均匀涂开即可达到菌落计数目的，但是菌落计数的最佳范围应该在平板放置6～9 h以内。
平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释，在规定的条件下培养后，所得1 ml或1 cm2样品中含菌落的总数。一般认为，一个肉眼可见的菌落代表原样品中的一个单细胞。选择合适的稀释度并乘以相应的稀释倍数就可以获得样品中微生物的数量。平板菌落计数法以其重复性好，能真实地反应样品中活菌数量的优势成为我国卫生标准规定的公认可行的方法，并且在食品药品研究领域得到广泛的应用。尤其在医药方面，控制口服制剂中微生物的污染状况是药品质量控制的重要指标，也是评价企业各生产环节卫生状况的重要手段和依据。另一方面，平板菌落计数法也可用于检测活菌制剂类药物的活菌数量。乳酸菌是食品工业和医药行业中被广泛应用的菌株之一，其活菌数的多少直接影响产品的质量和功能。因此，研究乳酸菌的平板菌落计数法的影响因素有助于提高其检测的准确程度，进而有效控制药品制作中微生物数量，提高产品品质。现将研究结果报告如下。
1、材料与方法
1.1材料MRS液体培养基：蛋白胨5 g，牛肉膏5 g，酵母粉5 g，胰蛋白胨10 g，吐温（Tween）-80 1 ml，葡萄糖20 g，磷酸氢二钾2 g，柠檬酸氢二铵2 g，乙酸钠5 g，硫酸镁0.5 g，硫酸锰0.25 g，蒸馏水定容至1000 ml，调节pH值至5.8，121℃灭菌15 min，用于菌体的活化。MRS固体培养基：MRS液体培养基添加2%（W/V）的琼脂粉，121℃灭菌15 min，用于菌落计数。BCN1360型生物洁净工作台；DHP-9082型电热恒温培养箱。
1.2方法菌体的活化从-80℃取出嗜酸乳杆菌复苏纯化，37℃、14 h活化两代。
1.2.1菌悬液的制备将上述活化后的第三代嗜酸乳杆菌菌液用0.85%（W/V）的无菌氯化钠溶液分别梯度稀释至10-5、10-6、10-7，备用。
1.2.2涂布方法及平板放置时间的影响检测分别采用圆形、井字、先圆形后井字和90°转动平板横线4种涂布方法，将10-5、10-6、10-7三个稀释度的菌液涂布在分别放置了3、6、9、12 h的MRS平板上。37℃培养48 h后，挑选菌落数在30～300的平板计数。
2、结果
2.1不同涂布方法对于活菌数的影响不明显，而对于同一涂布方法来说，平板放置12 h后，微生物生长的菌落数最低。见图1。
2.2通过观察发现不同涂布方法相对标准偏差均大约在10%以内。见表1。
3、讨论
“2.1结果”可能是由于培养基在放置12 h后内部的水分活度没有其他时间段利于微生物的生长。由于在试验过程中发现平板放置3 h时培养基表面较滑，不利于涂布操作。综合考虑，选择放置6～9 h的平板更适于菌落计数。
测定样品中的菌数方法主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、浊度测量法、粒子计数法、三磷酸腺苷（ATP）生物发光法、电阻抗测量法、放射测量法、接触酶测量法等。这些方法都存在各自的适用范围及优缺点。平板菌落计数法具有能检测出活菌数，更真实地反映样品状况以及重复性好，样品中菌数高或低都适用的特点，因此在药品研究及实践中广泛应用。但是对于平板菌落计数法的影响因素研究却甚少，通过本研究发现，涂布方法对于平板菌落计数的影响是不显著的。相反，平板的放置时间对于最终菌落计数的结果有显著性影响，当培养基放置时间过长（>12 h）时，水分活度的改变会影响所培养微生物的生长。这利于提高平板菌落计数的准确性，对更好地控制食品、药品中微生物的数量具有重要意义。