巨大芽孢杆菌BM24生长曲线、耐药性、益生潜力评估及药敏试验（二）
1.2试验方法
1.2.1芽孢杆菌分离
取新鲜粪便放入无菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，涡旋混匀，水浴锅80℃加热处理20 min，静置后取100μL上清液接种于LB肉汤中，37℃下恒温培育18 h，梯度稀释，取10-4、10-5和10-6稀释度的菌液于LB琼脂平板上涂布，倒置培养。挑出不同形态的单菌落，接种纯化3代，直至平板上的菌落形状、大小、颜色一致，采用革兰氏染色与芽孢染色法观察形态，镜检筛选出形态呈杆状且有内生孢子的菌株，将其菌液与60%灭菌甘油等体积混合，于-80℃冻存备用。
1.2.2分离菌株生化鉴定
使用HBI芽孢杆菌生化鉴定条对分离菌株进行生化反应鉴定，鉴定结果与《伯杰氏系统细菌手册》比对。
1.2.3分离菌株16S rRNA基因序列分析
参考水煮法提取细菌DNA作为PCR扩增模板，细菌通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')用于PCR扩增鉴定，引物序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。扩增体系:Premix Taq 10μL，上、下游引物各0.5μL，基因组DNA 5μL，ddH2O 4μL。PCR反应条件:95℃预变性3 min;95℃变性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸30 s，共30个循环;72℃延伸5 min;扩增产物4℃保存。用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，将PCR扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序分析，测序结果上传于NCBI网站进行序列比对，分析其种属。
1.2.4分离菌株的益生潜力评估
1.2.4.1耐酸性
调整LB肉汤的pH分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0，灭菌后备用。将冻存的分离菌株接种至LB肉汤，37℃、180 r/min摇床过夜培养，按1%的接种量接入不同pH的LB肉汤中，37℃摇床培养4 h后吸取200μL菌悬液至酶标板中，于酶标仪检测其在600 nm处的吸光度(OD600)值，以LB肉汤(pH 7.0)为对照，测量样品分为3份，每份重复测定3次，计算菌株相对存活率。
相对存活率(%)=(试验组OD600值/对照组OD600值)×100。
1.2.4.2耐胆盐
配制分别含有0.1%、0.2%、0.3%胆盐的LB肉汤备用。将冻存的分离菌株接种至LB肉汤，37℃、180 r/min摇床过夜培养，按1%的接种量接入不同胆盐浓度的LB肉汤中，37℃摇床培养4 h后吸取200μL菌悬液至酶标板中，于酶标仪检测其OD600值，以不添加胆盐的LB肉汤为对照，测量样品分为3份，每份重复测定3次，按照1.2.4.1中公式计算菌株相对存活率。
1.2.4.3药敏试验
采用纸片扩散法(K-B法)测定分离菌株对青霉素G、万古霉素、链霉素等15种抗菌药物的抗生素敏感性。取100μL过夜培养的菌悬液均匀涂布于LB琼脂培养基上，再将所选药敏片贴在培养基表面，并轻轻压实，于37℃恒温培养箱中过夜培养，通过测量药敏片周围抑菌圈直径大小来判断菌株的药物敏感性。结果判定参照《纸片法抗菌药物敏感试验标准》(WS/T 125-1999)。
1.2.4.4溶血活性
使用无菌脱纤维绵羊血制备绵羊血平板备用。分离菌株活化后在绵羊血平板上划线，于37℃恒温培养箱中过夜培养，观察菌落周围是否出现溶血环。
1.2.4.5抗菌活性
采用牛津杯法测定分离菌株的抗菌活性。将病原菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌)均匀涂布于LB琼脂培养基，将牛津杯放置于LB琼脂平板上，轻轻按压，在牛津杯中加入200μL(108 CFU/mL)分离菌株的菌悬液，37℃恒温培养箱过夜培养，测定抑菌圈直径。
1.2.5生长曲线
取过夜培养的菌悬液，按1%的接种量接入LB肉汤中，37℃、180 r/min振荡培养24 h，每隔2 h取菌悬液1次，共取12次，以无菌LB肉汤为对照，利用微生物生长曲线分析仪测定OD600值，重复测定3次，绘制生长曲线。
1.2.6体内安全性
参照农业农村部制定的《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》对分离菌株进行安全性评估。
1.2.6.1灌胃
10只小鼠适应环境7 d后随机分为2组，对照组灌胃生理盐水(0.2 mL/只)，试验组灌胃活菌数为108 CFU/mL的分离菌株(0.2 mL/只)，持续灌胃14 d。小鼠自由采食和饮水。每日灌胃前记录小鼠的体重变化，同时观察小鼠毛色、整体精神状态及分泌物、排泄物状况。灌胃结束后，采集小鼠血液，进行血细胞指标分析;将小鼠安乐死后取肝脏、脾脏、肾脏，无尘纸擦干表面水分后称重，计算脏器指数。
脏器指数(%)=[脏器重(g)/体重(g)]×100。
1.2.6.2腹腔注射
10只小鼠适应环境7 d后随机分为2组，对照组腹腔注射生理盐水(0.2 mL/只)，试验组腹腔注射活菌数为108 CFU/mL的分离菌株(0.2 mL/只)，小鼠自由采食和饮水，仅在第1天注射，观察小鼠毛色、整体精神状态及分泌物、排泄物状况，连续观察7 d。7 d后将小鼠安乐死，解剖观察各组织器官是否存在病理变化。
1.3数据处理与分析
试验数据用SPSS 26.0进行t检验，GraphPad Prism 8作图，数据结果表示为平均值±标准差。P<0.05表示差异显著，P>0.05表示差异不显著。
相关新闻推荐
2、不同微生物菌剂处理对秸秆降解率、可培养细菌/真菌/放线菌数量影响