柑桔砂皮病菌座壳菌生长条件及纳米药剂筛选（二）
2结果与分析
2.1病原菌分离与鉴定
2.1.1形态学鉴定从采集病样中,分离和纯化培养获得3个分离物,分别接种于PDA上24℃培养,观察病菌形态特征和分生孢子。其中,S2菌株的菌落白色,有花瓣状轮纹,气生菌丝与培养基上菌丝较为发达,未产生分生孢子。应用菌饼接种法接种分离菌株于刺伤柑桔果实上,S2菌株可产生明显的砂皮病症状,且从发病组织上再分离得到的菌与接种菌相同(见图1)。
图1柑桔砂皮病叶分离所得S2菌株在PDA培养基上的菌丝形态及菌落形态
2.1.2分子鉴定利用rDNA-ITS序列在NCBI数据库进行同源性比对,结果显示S2菌株与Diaporthecitriasiana(KJ490616.1、MN816406.1)的同源性为100%。系统进化分析结果显示,S2菌株与Diaporthecitriasiana(亚洲柑桔间座壳)聚类到一起,形成明显分支(图2)。
综合菌株的培养性状、形态特征和rDNA-ITS序列比对结果,将S2菌株鉴定为Diaporthecitriasiana。
2.2病菌生物学特性
2.2.1培养基的影响试验结果看出,S2菌株在4种供试培养基上均能生长,但菌丝形态和扩展速度存在差异。在OA上,菌落白色,边缘棉絮状,无轮纹,菌丝稀薄,菌丝扩展速度最快,培养7 d,菌落直径达到55.50 mm。在CA上,菌落灰色,边缘白色、棉絮状,具花瓣状轮纹,菌丝旺盛,菌丝扩展速度最慢,培养7 d菌落直径为44.05 mm。在PDA上,菌落白色,边缘规则,具花瓣状轮纹,菌丝旺盛,培养7 d菌落直径54.80 mm。在PSA上,菌落中心棕色,边缘棉絮状,无轮纹,菌丝稀薄,培养7 d菌落直径52.33 mm(见图3)。
图2柑桔砂皮病叶分离所得S2菌株在不同培养基上培养7 d的菌落形态
2.2.2碳源的影响在不同碳源Czapek培养基上,S2菌株均能生长,但菌落形态和菌丝扩展速率存在差异。碳源为可溶性淀粉时培养10 d的菌落直径63.50 mm,碳源为蔗糖处理时培养10 d的菌落直径仅44.75 mm,两者差异显著(见图4)。
图4柑桔砂皮病叶分离所得S2菌株在不同碳源Czapek培养基上培养10 d的菌落形态
2.2.3氮源的影响在不同氮源Czapek培养基上,S2菌株均能生长,但菌丝扩展速率存在差异。氮源为蛋白胨时培养10 d的菌落直径达到70.40 mm,氮源为氯化铵时培养10 d的菌落直径仅33.3 mm,两者差异显著(见图5)。
注:赖氨酸氮源处理培养基呈黄色,未接种菌株前即呈黄色。
2.2.4光照的影响不同光照条件下,S2菌株菌丝扩展速率存在差异。在全光照条件下,菌丝扩展速度最快,培养10 d的菌落直径80.60 mm;在光暗交替条件下,菌丝扩展速度最慢,培养10 d的菌落直径77.30 mm(见图6)。
图6柑桔砂皮病叶分离所得S2菌株在PDA培养基上不同光照条件培养10 d的菌落形态
2.2.5温度和pH值的影响S2菌株在15～30℃范围内均能生长,35℃时不能生长,最适合生长的温度为20～30℃(见图7)。S2菌株在pH值5～9范围内均能生长,最适合生长的pH值范围为5～7。
2.2杀菌剂和纳米试剂的室内毒力
3种杀菌剂对S2菌株的抑制作用强,EC50值为40%吡唑醚菌酯·喹啉铜SC<32%噻呋·氟环唑SC<430 g/L戊唑醇SC,抑制效果为40%吡唑醚菌酯·喹啉铜SC>32%噻呋·氟环唑SC>430 g/L戊唑醇SC。3种纳米试剂对S2菌株的抑制作用较强,且同种试剂浓度越高,菌落直径越小,抑制率越高。在纳米试剂中,SiO2纳米试剂的毒力最强,EC50为1.024μg/mL;星状阳离子聚合物(SPc)纳米载体的毒力最弱,EC50为6.928μg/mL。
3讨论与结论
前人研究表明,不同地域条件对病原菌的生物学特性基本无显著影响,而相同菌株在不同培养条件下的生物学特性存在差异。本研究分离鉴定获得的柑桔砂皮病菌S2菌株,在不同培养条件下的生物学特性与前人研究结果基本一致。该菌株对甘油、麦芽糖和可溶性淀粉等碳源的利用效果较佳,菌丝扩展速度最快;对蛋白胨氮源的利用效果最好;在15～30℃均能生长,最适生长温度为20～30℃,致死温度为35℃;pH值5～9均能生长,最适pH值为5～7;光暗交替培养时,菌落才出现花瓣状轮纹。
室内毒力测定结果表明,3种杀菌剂对柑桔砂皮病菌S2菌株的抑制作用强,与前人研究结果一致,其中,40%吡唑醚菌酯·喹啉铜SC抑制作用最强,EC50值为1.024μg/mL。供试纳米试剂对柑桔砂皮病菌S2菌株均具有较强抑制作用,抑制效果为SiO2纳米试剂>土霉素碳量子点纳米试剂>星状阳离子聚合物(SPc)纳米载体。SPc纳米载体具有高效、简便及安全的纳米传递系统,可有效提升药剂活性,在本试验中SPc纳米载体单独使用即可达到较好的抑制效果,EC50为6.928μg/mL,后期结合筛选出的化学药剂,提升效果的潜力巨大,但有待于进一步验证。国内目前针对柑桔砂皮病菌,室内筛选出的杀菌剂以苯醚甲环唑、吡唑醚菌酯、咪鲜胺、代森锰锌等杀菌剂为主,EC50范围为0.099～0.950μg/mL,杀菌效果显著。测定了33种杀菌剂对柑桔砂皮病菌的毒力,表明双胍三辛烷基苯磺酸盐毒力最强(EC50为0.011 2μg/mL),氟硅唑、多菌灵、咪鲜胺锰盐、吡唑醚菌酯、肟菌·戊唑醇、唑醚·代森联、苯醚甲环唑、咪鲜胺和戊唑醇的毒力较强(EC50均在1μg/mL以下),并推荐田间以使用氟硅唑和多菌灵为主防控柑桔砂皮病。田间防控砂皮病发现,代森锰锌等保护性杀菌剂具较好防效,但需连续多次施药才能达防控效果,人工成本和用药成本高,且易造成环境污染。将矿物油等增效剂与农药联用可以增加农药黏性,增强药效,达到减量增效的目的。纳米材料具有小尺寸效应、大比表面积、高反应活性、量子效应等理化特性,这些特性使得纳米材料应用于农药时,能提高农药对生物靶标表面的黏附性和渗透性,减少流失和分解,控制农药释放速度,延长农药持效性,提高农药利用率。目前在我国还未见关于纳米农药用于柑桔砂皮病防控的报道。本试验筛选的3种纳米试剂对柑桔砂皮病菌都表现出较强的抑制作用,为纳米农药用于柑桔砂皮病的防控提供了依据。
在本研究中,未能测定柑桔砂皮病菌S2菌株的产孢时间及产孢量,也未涉及纳米试剂与农药混合使用的效果及纳米试剂对农药药效的影响等内容。这有待于进一步研究。
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