巨大芽孢杆菌BM24生长曲线、耐药性、益生潜力评估及药敏试验（四）
3讨论
3.1羊源巨大芽孢杆菌BM24体外益生潜力
宿主和肠道菌群之间存在着特异性相互选择关系，动物肠道内的微生物更易在本体动物内繁殖和定植。因此，理想的羊用益生菌株应该来自健康羊的胃肠道。本研究从健康新疆细毛羊新鲜粪便中分离得到1株巨大芽孢杆菌，命名为巨大芽孢杆菌BM24，并对其进行体外益生潜力和小鼠体内安全性评价，以为今后养羊业羊源益生菌的应用提供参考。
良好的益生菌特性是:耐酸耐胆盐、无溶血活性、抗生素敏感性、抗有害微生物活性。益生菌在宿主肠道定植并发挥作用，候选菌株需要对胃的酸性和肠道的胆汁盐具有一定的耐受性，动物胃液的pH通常在3.0左右，羊肠道中的胆盐浓度在0.03%~0.30%。有研究发现，来源于绵羊乳制品中的植物乳杆菌对低pH及高浓度胆盐有较好的耐受性;田亮金等研究表明，在人工胃液和肠液的作用下，巨大芽孢杆菌A20、A27、B47和B89的存活率均可高于60%。本试验分离出的羊源巨大芽孢杆菌BM24在pH为3.0时存活率为73.63%，pH为1.0时仍有28.28%的存活率，表明其具有良好的耐酸能力;同时，该菌株能够在0.1%~0.3%胆盐下存活，有较好的胆盐耐受性，与不同种属的芽孢杆菌耐胆盐特性相似，表明羊源巨大芽孢杆菌BM24能够耐受胃肠道环境。
益生菌具有在肠道中转移抗生素抗性基因至病原菌中的潜在能力，因此候选益生菌在应用前必须进行抗生素耐药性评估。本研究使用15种常见抗生素对羊源巨大芽孢杆菌BM24进行药敏试验，发现其对其中12种抗生素表现出高度敏感，表明该菌株的耐药性低，安全性高。有研究发现，羊源地衣芽孢杆菌对万古霉素、庆大霉素和四环素等抗生素敏感;徐淑琴等发现，来源于藏羊瘤胃液中的1株沙福芽孢杆菌对青霉素类、氨基糖苷类及多肽类等抗生素表现出敏感性;陈永亮等从散养草鸡内脏中分离出的1株巨大芽孢杆菌201706J对诺氧沙星、环丙沙星、卡那霉素、庆大霉素、链霉素等常用抗生素均敏感，与本试验结果一致。候选益生菌是否有溶血性是评估菌株益生潜力的重要条件之一，本研究分离得到的羊源巨大芽孢杆菌BM24不具有溶血活性，与周海欧等的研究结果相一致。
已有研究表明，芽孢杆菌可通过分泌细菌素、磷脂类、抗菌肽等抗菌物质，破坏病原菌的细胞壁和细胞膜，抑制病原菌的生长。Rajput等研究发现，从羊奶中分离到的肠球菌具有抑制金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及铜绿假单胞菌生长的作用。来源于育肥绵羊空肠的海氏肠球菌对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌具有一定的抑制效果。巨大芽孢杆菌L2发酵产物LE4-3可抑制胡萝卜软腐欧文氏菌EC-1生长。菌株L2粗提物LE4-5对2种食品植物病原菌株青枯雷尔氏菌RS-2和根癌农杆菌T-37的生长均有较好的抑制效果。有研究发现巨大芽孢杆菌JX-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌有很强的抑制效果，巨大芽孢杆菌N17-12对副伤寒沙门氏菌和大肠杆菌有明显的抑制作用。巨大芽孢杆菌MIT411对大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、金黄色葡萄球菌以及空肠弯曲杆菌有良好的抗菌活性。在本研究中，羊源巨大芽孢杆菌BM24对常见腹泻致病菌大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌均表现出良好的抑制能力。
益生菌进入肠道后，通常需要快速定植并迅速生长，从而在微生物竞争中获得优势，成为优势菌群。赵龙妹等研究发现，巨大芽孢杆菌XT2在2~10 h进入对数生长期，菌体增殖迅速，10~20 h进入生长稳定期。本研究分离得到的羊源巨大芽孢杆菌BM24在2~6 h即可进入对数生长期，表明其具有良好的生长特性。
3.2羊源巨大芽孢杆菌BM24体内安全性
潜在益生菌株在投入生产前需要进行体内安全性评价，急性口服毒性试验是评价益生菌是否安全的最基本安全性评估试验。钟罗华等研究发现，连续口服巨大芽孢杆菌液1周，整个试验期间小鼠无死亡及腹泻，且巨大芽孢杆菌组小鼠体重有明显的增加。在其他潜在益生菌株体内安全性研究中，白海等以小鼠为动物模型评估了枯草芽孢杆菌的安全性。Abid等从牛奶中分离发酵乳杆菌而后通过21 d连续灌胃小鼠证明其是安全无毒的。张楠驰等采用高浓度菌悬液灌胃小鼠的方法评价羊源解淀粉芽孢杆菌fsznc-06的安全性，结果表明该菌对小鼠未造成负面影响。向微微等通过对小鼠进行经口灌胃及腹腔注射试验发现羊源弯曲乳杆菌Y15具有良好的安全性。Hou等发现，绵羊源地衣芽孢杆菌B63对昆明小鼠及SD大鼠无毒副作用。本试验中，腹腔注射羊源巨大芽孢杆菌BM24后的7 d观察期间，小鼠的生理状态均正常，无发病和死亡，解剖后小鼠体内脏器眼观均无异常症状，表明羊源巨大芽孢杆菌BM24无急性致病性;经过连续14 d的灌胃羊源巨大芽孢杆菌BM24，发现所有小鼠的饮水、采食、粪便及活动均正常，无小鼠死亡;灌胃试验结束后，试验组与对照组相比，小鼠体重、血细胞指标均无显著差异，肝脏、脾脏、肾脏均未发现明显的病理变化，且2组小鼠脏器指数无显著差异。综上所述，本试验分离得到的菌株羊源巨大芽孢杆菌BM24对小鼠无毒副作用，作为益生菌来使用是安全的。
4结论
本研究从健康细毛羊粪便中分离的巨大芽孢杆菌BM24不仅在体外表现出对酸和胆盐良好的耐受性，对多种常见抗生素敏感，对沙门氏菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长具有抑制作用，不具有溶血活性，生长速度快，而且在小鼠体内通过灌胃和腹腔注射试验证明了其具有良好的安全性，可作为羊源益生菌菌株今后在养羊产业中使用。