发根农杆菌Ri质粒构建灯盏花发根最优的培养体系（一）
为建立灯盏花的发根培养体系，用C58C1发根农杆菌空菌株和携带目的基因的菌株转化灯盏花叶片获得发根，测定发根的生长曲线，比较不同因素对发根生长量的影响。结果表明：利用发根农杆菌C58C1菌株成功从灯盏花中诱导出了发根，并建立了灯盏花发根最优的培养体系，其诱导的最佳农杆菌菌液浓度为OD600=0.6，最佳浸染时间为10 min，最佳共培养时间为2 d，在此条件下诱导率高达60%。经PCR鉴定证明Ri质粒的T-DNA已成功转化灯盏花的发根。
灯盏花(Erigeronbreviscapus)又名灯盏细辛、短葶飞蓬，为菊科飞蓬属多年生草本药用植物，全草入药。其主要有效成分为灯盏乙素，又名野黄芩苷。灯盏乙素具有舒张血管、改善微循环、抑制血小板及红细胞聚集，治疗冠心病、心绞痛、肾衰和高血脂症等疾病，具多种作用。但是作为云南最有发展前景的药物之一，却面临着因滥采滥挖及种质退化导致资源紧缺的严峻挑战。因此，从处于代谢节点处的关键基因着手，改善灯盏花的种质，提高灯盏花素的含量成为亟待解决的问题。
目前，灯盏花种质资源的改善主要依靠人工栽培驯化，驯化改善的灯盏花品种中有效成分灯盏乙素虽然可达1.053%～2.628%，但仍有很大提升空间，而且还面临着种质很容易退化的严重问题。植物细胞的遗传转化是植物基因工程的一个关键环节。以发根农杆菌(Agrobacteriumrhizogenes)Ri质粒为载体可将植物次生代谢物合成关键酶基因整合到植物基因组中并表达，从而达到稳定改良植物性状、提高次生代谢物含量的目的。发根体系具有操作过程简便，遗传稳定性强，生长快、易于培养获得转基因材料等优势，发展潜力巨大。
植物次生代谢工程技术的应用已在多种植物中取得成果，如将矮牵牛(Petuniahybrida)中黄酮代谢途径中的查尔酮异构酶基因CHI导入西红柿中并过量表达，使转基因西红柿中果皮黄酮醇含量提高了78倍。过量表达莨菪类生物碱合成的关键酶基因PMT和H6H，成功将莨菪转基因发根中东莨菪碱的含量提高了9倍。过表达丹参JAs合成途径中的关键酶基因AOC、AOS和JMT，显著提高了丹参发根中丹参酮ⅡA的含量。过量表达关键酶基因PLR成功提高了菘蓝发根中落叶松脂素的含量等。而对于灯盏花，目前尚无建立遗传转化体系的报道。
本研究利用发根农杆菌Ri质粒成功地从灯盏花叶片诱导出发根，初步建立了最适灯盏花发根培养的遗传转化培养体系，为进一步利用遗传代谢工程手段调节灯盏花次生代谢物含量提供了可行方法，以期用此方法部分替代野生资源，减轻滥采滥挖现状及解决种质退化问题。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1材料来源
供试灯盏花种子由西南林业大学刘江华教授提供，农杆菌C58C1由第二军医大学药学院保存。
1.1.2试剂
试验用到的HgCl2，MS、B5、YEB等培养基，蔗糖，琼脂，琼脂糖凝胶，头孢、潮霉素、利福平等抗生素，各试剂均为国产分析纯试剂。rolB、rolC基因引物由苏州金唯智生物公司合成。PCR反应的rTaqDNA聚合酶Mix购自Takara生物公司。
1.2试验方法
1.2.1植物材料处理
灯盏花种子用0.1%升汞浸泡10 min消毒，无菌水冲洗3～5次，灭菌吸水纸吸除残留水分。将灭菌种子播种到MS固体空白培养基上，置于4 000 lx、16 h日光照，25℃条件下培养。种子3～5 d后开始发芽，大约15 d后长出无菌实生苗，45～60 d长成可供剪取叶盘的灯盏花无菌苗。
1.2.2发根农杆菌菌株活化
取-80℃冻存的C58C1菌液，于含40 mg/L利福平(Rif)的YEB平板上划线，28℃恒温暗培养2 d。挑取单菌落于1 mL YEB(含40 mg/L Rif)液体培养基中活化培养12～16 h。取活化的C58C1菌液200μL加入到30 mL YEB(40 mg/L Rif)液体培养基中28℃，200 r/min振荡培养至菌液OD600分别为0.4、0.6、0.8。常温下，5 000 r/min离心10 min，去上清，分别加30 mL B5、1/2B5、1/2MS、MS(均含100μmol/L乙酰丁香酮)液体培养基重悬菌体，28℃，100 r/min振荡孵育30 min，用以浸染叶盘。最后统计分析不同浓度的菌液对转化效率的影响。
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