香芹酚对恶臭假单胞菌生长、运动能力、产胞外蛋白酶和生物被膜能力影响（一）
摘要：以恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）为对象，通过测定恶臭假单胞菌生长曲线、群集性、泳动性、核酸泄漏情况及产胞外蛋白酶和生物被膜能力等指标，考察不同体积分数香芹酚对恶臭假单胞菌的抑菌效果。结果表明：当香芹酚体积分数≥0.015%时，对恶臭假单胞菌的生长、运动能力、产胞外蛋白酶和生物被膜能力具有极显著抑制作用（P＜0.01）；当香芹酚体积分数为0.025%时，恶臭假单胞菌所产生物被膜含量比空白组极显著减少86.35%（P＜0.01）。香芹酚可通过抑制生长、产生物被膜能力及运动能力破环细胞膜通透性，导致大量细胞内容物泄漏，从而对恶臭假单胞菌产生抑菌作用。
假单胞菌是导致肉类腐败变质的主要微生物之一，多种假单胞菌作为肉中的优势腐败菌常被检出，如恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）、莓实假单胞菌、荧光假单胞菌等，假单胞菌可致高蛋白质食品腐败，如肉及肉制品、乳制品、水产品等，从而影响产品质量，缩短货架期，造成严重经济损失甚至导致人群食物中毒，有效抑制假单胞菌是鲜肉保鲜的关键手段之一。恶臭假单胞菌是一种条件致病菌，广泛分布于泥土和水体环境中，有研究表明，在70余批常规送检的冷冻肉类中均检出恶臭假单胞菌。香芹酚是一种天然的酚类化合物，是百里香和牛至精油的主要成分，香芹酚应用较为广泛，常作为食品防腐剂或香料。
香芹酚作为一种天然、安全防腐剂，已被美国食品药品监督管理局列为公认安全的食品成分。研究发现，香芹酚具有抗菌活性，对单核细胞增生李斯特氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和沙门氏菌等食品中常见的食源性致病菌均具有抑制作用。与其他抑菌剂相比，香芹酚具有无毒、安全性高、抗菌性强等优点。Xiao Longquan等以香芹酚、壳聚糖等为原料制备的抗菌膜可将羊肉的保鲜期延长15 d以上。目前，对于恶臭假单胞菌的研究限于药敏分析、生物学功能研究等，用天然精油抑制恶臭假单胞菌的研究较少，因此，研究香芹酚对恶臭假单胞菌抑制作用十分有意义。本研究以恶臭假单胞菌为研究对象，对比不同体积分数的香芹酚对恶臭假单胞菌的抑菌效果，并探究香芹酚的抑菌机制，为香芹酚在肉及肉制品、乳制品、水产品中的应用提供理论依据。
1材料与方法
1.1材料与试剂恶臭假单胞菌（ATCC 49128）上海鲁微科技有限公司；香芹酚（纯度99%）上海麦克林生化科技有限公司；Luria-Bertani（LB）营养琼脂、蛋白胨、胰蛋白胨、琼脂粉（生物试剂）北京奥博星生物技术有限责任公司；溶菌肉汤（LB肉汤）、乙醇、结晶紫、脱脂奶粉、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）（分析纯）天津市恒兴化学试剂制造有限公司。
1.2仪器与设备
UV-2700i紫外-可见分光光度计岛津仪器苏州有限公司；LRH-150生化培养箱上海一恒科学仪器有限公司；THZ-82水浴恒温振荡器常州澳华仪器有限公司；LDZX-75L立式高压蒸汽灭菌锅上海申安医疗器械公司；TGL-22S高速冷冻离心机四川蜀科仪器有限公司；1550酶标仪上海赛默飞世尔仪器有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台苏州安泰空气技术有限公司。
1.2方法
1.3.1生长曲线测定
微生物生长曲线是描述微生物生长状况的基本指标。将恶臭假单胞菌接种至LB肉汤，放置于水浴恒温振荡器中，温度调至30℃，过夜培养活化后取出，将OD600 nm调至约为1.00，置于锥形瓶中，用LB肉汤以1∶100比例稀释，加入香芹酚，使其最终体积分数分别为0.005%、0.010%、0.015%、0.020%和0.025%，各梯度均用体积分数0.1%DMSO助溶，同时做空白对照和DMSO对照。将样品置于30℃水浴恒温振荡器中振荡培养，分别于0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、26 h时取样，用紫外-可见分光光度计测定OD600 nm。