毕赤酵母植酸酶发酵工艺优化：比生长速率多少时甲醇流加补料效果最为理想？
植酸酶作为一种高效的饲料添加剂，在动物体内可以帮助其降解植酸盐，改善磷和其他养分的消化吸收，减少养分排泄，提高磷的利用率，增加养殖户的经济效益，同时对降低植酸磷对环境的污染有重要作用。目前，养殖业对植酸酶的需求越来越大，同时更加关注其成本。因此，提高植酸酶表达量，降低发酵成本成为植酸酶研究、生产的当务之急。
毕赤酵母植酸酶发酵工艺优化的研究已有很多报道。李洪淼等对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了实验，并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补料方式的研究。黄魁英等[2]对植酸酶毕赤酵母基因工程菌PEY-2的发酵条件进行了研究。郭美锦等对重组毕赤酵母表达工程植酸酶过渡相参数进行了分析研究。闵兆升等采用单因素试验和正交试验考察了不同工艺条件对毕赤酵母工程菌H311产植酸酶的影响。王兴吉等对毕赤酵母H工程菌30 L发酵产植酸酶的发酵条件及该酶的热稳定性进行了研究。
1研究方法
1.1实验材料
1.1.1菌株
重组毕赤酵母基因工程菌(Mut+)，由本公司自行构建，分泌表达植酸酶。
1.1.2培养基
种子培养基为酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)培养基，发酵培养基为基础盐(BSM)培养基(用葡萄糖替换甘油)。
1.2方法
1.2.1种子培养
将保藏菌种接种到50 mL的YPD培养基中培养18～24 h，再按照10%接种量接种YPD培养基扩培16～24 h，然后按照8%接种量接入发酵罐BSM培养基中发酵培养。
1.2.2发酵控制
流加氨水控制pH 4.5，底糖耗尽后通过流加含12 mL/L微量盐(PTM1)培养基的60%的葡萄糖增加湿重，控制相同湿重(180 g/L左右)开始诱导，根据实验需求和测量的湿重控制不同比生长速率(μ)0.01 h-1、0.015 h-1、0.02 h-1进行相应的甲醇补料诱导植酸酶表达。每隔8 h或16 h取样测湿重，然后调节甲醇补料量为湿重与比生长速率乘积。
1.2.3分析方法
细胞湿重测定：10 mL发酵液10 000 r/min离心10 min后弃上清称重；植酸酶酶活测定：GB/T 18634—2009饲用植酸酶活性的测定分光光度法[12]。
2结果与讨论
2.1对照实验
发酵液底料中含有30 g/L葡萄糖，葡萄糖耗尽之后DO回升，此时开始流加60%的葡萄糖直至诱导所需湿重180 g/L(大约发酵时间24 h时)，之后停止流加葡萄糖，饥饿30 min左右，开始流加甲醇诱导产酶。对照组甲醇流加策略参照Invitrogen毕赤酵母发酵手册[13]进行控制，速度从1 g/(L·h)开始，每两小时提高0.5 g/(L·h)，直到甲醇流加速度为4.5 g/(L·h)时，停止继续提高，并以该流速至发酵结束。
由图1可知，发酵40 h时(大约诱导后15 h左右)，湿重186 g/L，酶活691 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间增加，发酵144 h时湿重出现轻微下降，最后两个取样点酶活基本相同，至发酵168 h时下罐，此时湿重408 g/L，酶活10 282 U/mL。
图1对照酶活湿重曲线
2.2比生长速率为0.01 h-1时的产酶状况
甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。甲醇流加速度从1 g/(L·h)开始，按照0.01 h-1乘以相应的湿重(每8 h或16 h取样测湿重，然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料。
由图2可知，发酵40 h时，湿重192 g/L，酶活583 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间增加，酶活168 h时出现轻微下降，至发酵168 h时下罐，此时湿重457 g/L，酶活11 763 U/mL。以0.01 h-1的比生长速率进行甲醇流加，发酵最终消耗甲醇5.3 L，而对照组甲醇消耗6.2 L，尽管甲醇消耗比对照少14.5%，但是酶活却比对照高14.4%。
图2比生长速率0.01 h-1时酶活湿重曲线
2.3比生长速率为0.015 h-1时的产酶状况
甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。甲醇流加速度从1 g/(L·h)开始，按照0.015 h-1乘以相应的湿重(每8 h或16 h取样测湿重，然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料。
由图3可知，发酵40 h时，湿重185 g/L，酶活423 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间增加，144 h时湿重出现下降，至发酵168 h时下罐，此时湿重482 g/L，酶活13 644 U/mL。以0.01 h-1和0.015 h-1的比生长速率进行甲醇补料，中前期酶活和对照相当甚至比对照低，但是随着发酵进行，菌体湿重增大，甲醇流加量增大，最终发酵酶活都超过对照组。
图3比生长速率0.015 h-1时酶活湿重曲线
2.4比生长速率为0.02 h-1时的产酶状况
甲醇诱导产酶之前的过程同2.1。甲醇流加速度从1 g/(L·h)开始，之后按照0.02 h-1乘以相应的湿重(每8 h或16 h取样测湿重，然后进行相应的甲醇流速调节)所得的速度进行甲醇补料。
由图4可知，发酵40 h时，湿重190 g/L，酶活712 U/mL，随后酶活和湿重随发酵时间一直增加，至发酵168 h时下罐，此时湿重524 g/L，酶活17 445 U/mL。以0.02 h-1的比生长速率进行甲醇补料时，酶活一直比对照和其他两个实验组高，可以推断前期菌体适应甲醇后，在一定范围内，甲醇量越高对产酶越有利。而以0.02 h-1的比生长速率进行甲醇流加，最终酶活比对照提高69.7%，因此，以合适的比生长速率控制甲醇流加，可能会引起菌体代谢流的改变，更多的代谢能量和物质流向产酶通路。
图4比生长速率0.02 h-1时酶活湿重曲线
由图5可知，随着底糖消耗DO逐渐降低，至16 h左右，底糖耗尽，DO回升，随之开始补糖流加，至发酵24 h左右湿重达到180 g/L，停糖饥饿30 min，此时DO大幅回升，然后按照1 g/(L·h)的速度流加甲醇3 h，之后按照各自甲醇流加策略分别进行甲醇流加。发酵中期DO水平与甲醇流加量相关，甲醇流加量大，DO水平低，而发酵后期DO基本都跌零，但是通过对发酵液进行液相检测，甲醇几乎没有残留。
图5不同比生长速率下的溶氧量曲线
3结论
以不同的比生长速率进行甲醇流加补料，发酵酶活均比对照提高。以0.01 h-1，0.015 h-1，0.02 h-1比生长速率进行甲醇补料，酶活分别提高14.4%，32.7%，69.7%。以比生长速率指导甲醇补料，既可以提高甲醇的利用率，又可以提高酶活力，从而降低发酵成本。受取样时间的限制，本文根据比生长速率进行甲醇流速调整的时间间隔为8 h或16 h，如果利用可以在线检测菌体密度的发酵反应器，根据测得的菌体密度在线实时反馈调节甲醇流量，可能会得到更优的结果。随着比生长速率的提高，酶活提高越多，在DO允许的情况下，继续提高比生长速率可能会更大地提高产酶量，而受反应器及DO的限制，本文得到的最适比生长速率为0.02 h-1。
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