微生物生长曲线监测仪测定纳米银对副溶血弧菌的最小抑菌浓度（三）
2结果与讨论
2.1 Ag NPs的特征
透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)表征结果显示，本研究中合成的大部分Ag NPs接近球形，且在水中具有较好的分散性(图2a)。随机分析100个颗粒的粒径(d,nm)，结果显示，平均值为(37±5)nm(图2b)。新制备的纳米材料最大光吸收峰出现在415 nm左右(图2c)，表现出Ag NPs的特征峰。该结果还表明，产物具有较好的形貌一致性和纯度。
图2 Ag NPs的TEM(右上角插图：其在水中的分散液照片)(a)、粒度分布图(b)和UV-vis光谱图(c)
2.2 EMGA法测定结果
科研界常通过分析纳米材料对微生物生长曲线的影响来推测该被分析物的抑菌效应。研究首先以河口水样S1作为代表探讨了复杂介质中Ag NPs对副溶血弧菌的作用。在河口水样S1中，10 5 CFU/mL的副溶血弧菌急性暴露于不同浓度的Ag NPs之后，暴露混合液直接转入预装有LB液体培养基的检测管中，采用EMGA法测定存活细胞的生长动力学曲线，结果如图3a所示。
Ag NPs浓度为0时(阳性对照)，三平行实验皆得到了重现性良好的反正弦型生长曲线，说明本实验条件下存活细菌很多且正常、稳定地增殖与生长。当河口水中Ag NPs浓度逐渐增大时，副溶血弧菌的生长调整期随之逐渐增加，直到出现直线型响应线(表明新陈代谢活动完全被抑制)。当生理盐水中Ag NPs浓度≥24.0 mg/L时，在该培养时间范围内没有反正弦型细菌生长曲线出现，根据国际通用规则，可以认为在本实验条件下Ag NPs对副溶血弧菌的MIC值为24.0 mg/L。为了验证EMGA法测定纳米材料抑菌活性的重现性和精密度，在一周内研究团队3名成员采用完全相同的操作方法分别进行了3次实验，测定了Ag NPs在河口水样品S1中对副溶血弧菌的MIC值，得到的MIC值皆为24.0 mg/L。该结果说明EMGA法具有良好的精密度和重现性。作为对比，实验采用BMD法和平板计数法测定了相同条件下Ag NPs对副溶血弧菌的抑制效应，结果分别见图3b和图3c。
图3 EMGA法(a)、BMD法(b)和平板计数法(c)测定AgNPs在河口水中对副溶血弧菌的抑制作用
由图3可知，BMD法和平板计数法测定的MIC值也为24.0 mg/L，说明采用EMGA法分析河口水中Ag NPs的抑菌效应时，所得数据和采用经典的BMD法和平板计数法所得数据具有良好的一致性。2.3 EMGA法性能分析实验采用EMGA法、BMD法和平板计数法分别测定了S1、S2、S3、S4、S5、S6、S7和S8共8个河口水样品中Ag NPs对副溶血弧菌的急性暴露影响，MIC值如表2所示。
结果表明，EMGA法测定结果和BMD与平板计数法测定的MIC值吻合性很好，基本符合(EA)达到75%；小偏差(mE)为25%，未发现大偏差(ME)，说明EMGA法测定Ag NPs对副溶血弧菌抑菌效应具有良好的准确性。
此外，EMGA法测定的MIC值往往大于或等于BMD法和平板计数法的测定结果，其原因在于自动化仪器的灵敏度高于肉眼观察。因此，EMGA法的抑菌效应测定结论比基于肉眼判断的结果具有更高的可靠性。Zhang等研究表明，采用OD法测定模拟河口水中纳米材料对大肠杆菌(Escherichia coli)的抑制效应时，细菌生长OD-t曲线因受共存物质光学信号的干扰而波动严重，导致无法读取MIC的准确值。
本研究采用BMD法和平板计数法测定河口水样中Ag NPs的抑菌效应时也需要采用离心法除去悬浮颗粒等干扰物，否则严重影响MIC值的准确读取(如图4所示)。由于MIC值和存活微生物的培养时间具有相关性，研究中培养时间全部采用20 h。
在这种情况下，如图5所示，采用EMGA法测定河口水样中Ag NPs对副溶血弧菌的影响时仅需要两步手工操作——将暴露后的混合物直接转移到检测管和上机测定存活细菌的生长动力学曲线，检测总周期为1 210 min。而采用BMD法和平板计数法都需要3个步骤，检测总周期为1 230 min。较之于经典的方法，EMGA法需要的手工操作步骤较少，意味着耗时、劳动力、费用和误差的降低，因此具有显著的性能优势。
表2 EMGA法、BMD法和平板计数法测定的MIC值
注：—表示Ag NPs在0~48.0 mg/L范围内未抑制住细菌的生长。
图4未去除悬浮固体情况下河口水的BMD(a)和平板计数(b)结果图像
图5 EMGA法(上)和BMD、平板计数法(下)测定Ag NPs在河口水中抑菌效应的流程和时效示意图
3结论
本研究建立了一种测定Ag NPs在河口水中抑菌效应的表型方法。该方法仅需要两步手工操作：1)直接将暴露混合液加入预装有LB液体培养基的检测管中；2)把检测管置入EMGA工作通道中测定存活细菌的生长动力学曲线。根据细菌生长曲线形状即可判读出该纳米材料在河口水中对副溶血弧菌的MIC值。较之于经典的测定方法(如BMD和平板计数)，其优势在于无需去除暴露混合液中诸如悬浮颗粒之类的复杂共存物，因此操作更简便、劳动强度小，总周期缩短至少20 min。此外，由于手工操作步骤较少，有效地降低了主观和客观误差风险。EMGA法测得的MIC值具有良好的精密度和重现性。同时，该基于传感器识别结果的自动化方法比BMD法和平板计数法具有更高的灵敏度。本研究为准确、高效地测定纳米材料在诸如河口水之类复杂介质中的环境毒理效应提供了新手段。