奥西替尼耐药肺癌脑转移颅内的原位PDX模型构建方法
奥希替尼是一种不可逆的EGFR酪氨酸激酶抑制剂，被批准用于EGFR敏感突变的非小细胞肺癌(nonsmall cell lung cancer，NSCLC)患者的一线治疗，及治疗后出现T790M突变患者的二线治疗。尽管有效，但随着治疗的推进，患者对奥希替尼出现耐药性不可避免，需要保持患者特征的细胞和小鼠模型来研究奥西替尼的耐药机制。
传统的细胞系以及其注射小鼠构建的动物模型，因为其细胞经过反复传代，丢失了患者的部分基因信息和表征。不能反映患者肿瘤的异质性、细胞之间的相互作用和精准判断治疗反应。患者来源脑肿瘤异体种植模型(Patient-derived xenograft,PDX)，是保存患者信息最全面、最能重复患者脑肿瘤生物学行为的模型，比传统细胞系好，能够准确模拟肿瘤异质性。另外一方面，从PDX转化来的患者来源肿瘤(PDXC)也保留了原始肿瘤的基因组和转录组特征，可以用于快速的细胞实验。
目前，学术界及商界常用于脑转移瘤研究的是人源的非小细胞肺癌细胞株A549，PC9，小鼠肺癌细胞株(Lewis lung carcinoma cells，LLC)，这些传统的细胞株构建的模型包括细胞和小鼠脑转移瘤模型，均不同程度的丢失了部分患者的遗传信息及表征，因此，需要构建患者来源肺癌脑转移原位PDX小鼠模型及PDXC细胞模型。
一种奥西替尼耐药肺癌脑转移颅内的原位PDX模型构建方法，包括：
步骤A：获取奥希替尼耐药患者的肿瘤标本，对肿瘤标本进行剔除掉电凝烧灼部分的肿瘤细胞，留取活性部分肿瘤；
步骤B：将肿瘤细胞保存在无血清的DMEM离心管中；
步骤C：取出肿瘤细胞，在培养皿中切成小片，加入第一培养液培养后进行吹打，并离心后获得单个细胞；
步骤D：立体定向仪固定，注射预设数量的肿瘤细胞至裸鼠的脑内；
步骤E：当小鼠出现体重明显下降，食欲差、或者神经系统症状时，收取部分裸鼠大脑；步骤F：冠状位切取有肿瘤的小鼠大脑，进行H＆amp;E切片染色及CK7、TTF-1免疫组化染色，与患者的H＆amp;E及免疫组化染色进行对比；
步骤G：在步骤F执行的同时，将剩余小鼠基于无菌显微镊分离颅内转移瘤，完整将小鼠PDX肿瘤取出并保存至无菌培养皿，无菌刀片将肿瘤切除预设尺寸的小块，无菌离心管收集预设尺寸的肿瘤小块，加入第一预设容量的第一培养液在培养箱中培养预设时长；加入第二预设容量的第二培养液，离心去上清，再加入第三预设容量的第二培养液，吹打细胞团，再加入第二预设容量的第二培养液，过滤器过滤，收集细胞悬液并计数，每个培养瓶一百万个细胞/10ml第二培养液接种，得到原位PDXC模型，并将部分细胞悬液继续接种至裸鼠颅内进行传代，完成耐药肺癌脑转移颅内原位PDX模型；
步骤H：在步骤G执行的同时，取部分细胞悬液中的细胞基于预设细胞数量接种于六孔板中的各个孔内，放入芬兰Bioscreen全自动微生物生长曲线分析仪（BIOSCREEN C°PRO全自动生长曲线分析仪能够高通量筛选目的菌株，并能在短时间内迅速完成培养条件的优化，因为BIOSCREEN C°PRO能够全自动日夜工作、培养、振荡、测量同步进行。），实时监控拍照，绘制生长曲线；
步骤I：将PDXC传代3代后，取部分细胞进行奥希替尼药物敏感性检测，对照组为HCC4006细胞株。