基于噬菌体基因组学的HPUFs筛选方法，系统识别噬菌体编码的有毒产物
耐药性细菌分离株的广泛出现给卫生保健带来了沉重的负担。研究人员开发新的有效的抗菌药以应对这一挑战已作出了重大努力。从不同的微生物中发现了多种具有抗菌活性的天然化合物。与植物和动物等天然产品来源相比，微生物作为一种来源更容易再生和再生。近年来病毒特别是噬菌体，已成为一种非常有效的抗菌素来源。噬菌体是感染细菌细胞的病毒。近年来，人们试图从噬菌体编码的抑菌蛋白和溶菌蛋白，如噬菌体编码的内溶酶、VAPGH(病毒相关的肽聚糖水解酶)、多糖解聚酶和穴蛋白等，开发出抗菌药物。许多致病菌对抗生素的耐药性迅速出现，迫切需要找到新的抗生素替代品。噬菌体，即微生物的病毒，表达特殊的蛋白质来取代它们所感染的细菌宿主的新陈代谢，其中最著名的是与细菌裂解有关的。然而大多数噬菌体编码基因产物的功能尚不清楚，噬菌体编辑基因产物代表了功能未知的假想蛋白(HPUFs)。在目前的研究中，研究人员提出了一种基于噬菌体基因组学的筛选方法来识别噬菌体HPUFs具有抗菌活性，研究的长期目标是利用它们寻找未知的线索目的开发新型抗菌化合物。筛选试验的基础是通过抑制细菌生长时，一个有毒基因的表达-克隆到一个质粒载体。Biosense微生物生长曲线监测系统应用于病毒的相关筛选试验，是首次测试和优化使用几个已知的有毒和无毒基因片段，将其应用于94个噬菌体R1-RT的HPUFs筛选，鉴定出4个对大肠杆菌有毒性的HPUFs（功能未知的假想蛋白）。
芬兰Biosense微生物生长动态监测系统应用
将1ml的M9t培养基中补充了100 ug/mL Amp(w/v)葡萄糖0.2%或0.2%(w/v)树胶醛醣接种1%洗细菌细胞的培养液将稀释后的菌液一式三份(300 uL/well)转入到2块Biosense蜂窝板中。使用Biosense全自动生长曲线分析仪每小时测定一次OD值(600 nm)，持续此测试16小时。该蜂窝板以较高的振幅和正常的速度不断地摇动。测量前10秒停止摇晃，立即开始测量。每次测试都经过超过三次测量后取平均值，然后直接将全自动生长曲线分析仪获得的噬菌体颗粒为模板进行PCR分析。
实验结果：功能阐明的抗菌噬菌体蛋白可以作为靶标识别和药物发现的有力工具，其研究进展十分有限，该研究提出了一种基于抗菌噬菌体蛋白作为靶标识别的筛选方法来识别有毒噬菌体HPFU能够抑制细菌生长的细胞内表达宿主细菌。研究发现了四种对大肠杆菌有毒性的HPFU。筛选试验使研究人员能够系统地从假想的噬菌体蛋白中检测和识别毒性基因，二这些蛋白并不是目前被业界作为抗生素开发的目标。这种优化的分析方法在原则上对寻找任何噬菌体的杀菌蛋白都是有用的，同时也为理解噬菌体用来取代细菌宿主的策略开辟了新的可能性。
图1、已知有毒和无毒基因的混合物转化效率的差异。柱状图显示了两个不同基因复制的样品的CFU/ng值的平均值。
图2、镀层试验筛选94个HPUF基因的相对CFU结果值。镀层效率与对照基因g178(A)、g246和g150(B)或g121(C)进行归一化的相对CFU值。
图3、在阿拉伯糖诱导启动子pBAD30控制下表达噬菌体蛋白的重组大肠杆菌在最小培养基M9t中添加了阿拉伯糖(A)或葡萄糖(B)基因表达及基因抑制的大肠杆菌生长曲线图。
图4、Gp232的92个残基(245aa-344aa)的预测其三级结构。图像由彩虹N端-C端着色。
图5、预测Gp136和Gp137的跨膜螺旋序列。a-α螺旋，b-β螺旋，t-TM螺旋。数字0-9表示Phyre2对二级结构预测的置信度。
总结：论文主要研究了基于噬菌体基因组学的HPUFs筛选方法，噬菌体编码的有毒产物。利用这种方法研究人员应用微生物生长曲线监测系统(Biosense)筛选了94个Yersinia噬菌体RNA-RT的HPUFs并鉴定了四种对大肠杆菌有毒的hpuf。利用研究人员提出的此种筛选方法，可以系统地从噬菌体编码中识别出有毒蛋白HPUFs。研究人员进一步提出，这些有毒蛋白反过来可以用来识别新的细菌药物发现的目标。应用微生物生长曲线监测系统(Biosense)测试阿拉伯糖诱导启动子pBAD30控制下表达不同类型的噬菌体蛋白的重组后大肠杆菌入到的蜂窝板中测试起生长曲线，此生长曲线分析仪主要是采用分光光度/浊度法测量获得对重组后大肠杆菌的生长曲线，该仪器结合2块100孔的微孔板可同时平行测试多个各种菌株样品的生长曲线，并且所有的过程都是自动化的。
本论文的研究人员全面研究了不同基因蛋白重组表达的大肠杆菌的生长情况，从而发现了四种对大肠杆菌有毒性的HPFU蛋白，而这些有毒蛋白反过来可以用来识别新的细菌药物发现的目标。此筛选试验使研究人员能够系统地从假想的噬菌体蛋白中检测和识别毒性基因。这种优化的分析方法在原则上对寻找任何噬菌体的杀菌蛋白都是有用的，同时也为今后研究人员理解噬菌体用来取代细菌宿主的策略开辟了新的可能性，这也看出微生物生长曲线监测系统（Biosense）在研究抗病毒蛋白药物研究方面也能发挥其重要的应用前景，该方法的使用也是今后开发高通量药物筛选法中最为关键的技术提供重要的技术支持。
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