微生物生长曲线监测系统：12种LAB发酵物对霉菌生长的抑制作用
霉菌腐败是乳制品行业的一个主要问题，导致大量食物浪费和巨大的经济损失。乳制品为霉菌生长提供了有利的环境，由于产品表面的生长，可以发现明显的变化。一些最常见的霉菌，例如青霉属和毛霉属，与乳制品腐败有关。为了避免食品工业中的真菌腐败，在产品制造过程中采取了很多措施来防止污染并抑制真菌生长。化学防腐剂已在食品工业中使用，以保护食品免受不良生长，从而延长产品保质期，但公众对化学防腐剂的广泛使用越来越关注。此外，越来越多的霉菌不仅对抗生素产生抗药性，而且对山梨酸和苯甲酸等食品防腐剂产生抗药性。近年来，消费者对最低限度加工或不含防腐剂的食品的需求不断增加，这导致人们对天然真菌控制替代品（例如抗真菌生物保护培养物）越来越感兴趣。选定的乳酸菌（LAB）通常被报道为潜在的生物保存工具，可以抑制不同食品中的真菌生长，延长保质期，有时甚至改善营养价值和感官特性。LAB菌株对抗腐败霉菌的活性机制被认为是多因素的，包括产生各种代谢物，包括挥发性化合物和非挥发性化合物。
本研究的目的是表征从新鲜发酵的乳制品（例如酸奶）中分离出的一组霉菌在三种温度下的生长潜力。通过评估霉菌与有或没有活细胞的LAB发酵物的直接相互作用效应，以及评估挥发物的作用的无直接接触，来研究霉菌对不同LAB制剂的敏感性。评估选定组合中12种LAB培养物对这些霉菌生长的抑制作用。研究锰消耗导致的竞争排斥在抑制中的作用。
丹麦Biosense微生物生长曲线监测系统的应用
在25°C下监测霉菌细胞生长24小时。使用微生物生长曲线监测oCelloScope检测系统（BioSense丹麦），这是一种新开发的光学检测系统，基于结合光学技术的独特光学扫描技术FluidScope TM。将每个霉菌的100微升MEB培养基中的孢子悬浮液（1.0×103孢子/mL）添加到96孔微孔板中（大约100个孢子/孔）。接种后将96孔微孔板在室温下静置约1小时，让孢子在这些孔中沉降，然后放入oCelloScope系统中。自动测量样品，并在24小时内每60分钟记录一次仪器得出的生长值。使用oCelloScope专用软件UniExplorer(v.5.0.3)的背景校正吸收(BCA)算法{BCA=log10[Σ（校正吸收像素直方图）]}进行自动生长动力学分析。对于每种霉菌菌株，通过三个技术重复进行生长测试。
实验结论
乳制品非常容易受到腐败霉菌的影响，因此表征霉菌的生长潜力至关重要。毛霉菌株在MEB培养基和酸奶中的生长速度都比青霉菌菌株快。除P.roqueforti ISI4外，所有测试的霉菌在MRS中生长时均受到12种LAB菌株的强烈抑制。从基于MRS的发酵液中去除LAB活细胞后，抑制效果下降，单独挥发物的效果更小，表明预形成的化合物发挥了作用，但它们不是主要的抑制因素。当使用酸奶血清作为培养基时，观察到乳酸菌生长减少和霉菌生长抑制较弱，而去除细胞导致活性几乎完全丧失。在某些情况下，通过组合培养物可以增强抑制功效。在酸奶中，植物乳杆菌LP37造成的锰消耗在青霉菌和毛霉菌测试菌株的生长抑制中发挥着重要作用。因此除了未受影响的P.roqueforti ISI4之外，这些腐败霉菌通常对能够使基质中的锰无法利用的生物保护培养物敏感。
图1、(A)oCelloScope监测的13种霉菌生长动力学分析。数据以三个重复的平均值表示。将MEB中每种孢子悬浮液100微升(1.0×103孢子/mL)加入96孔微孔板中，一式三次，25℃孵育24 h。4株毛霉的生长曲线为点线，9株青霉的生长曲线为实线。(B)在MEB培养基中生长的P.solitum ISI5(a)和M.circinelloides 01180023(B)的ocloscope图像。比例尺:104μm。对13个霉菌在25°C下在MEB培养基中24小时的生长动力学分析（图1A）表明，所有测试霉菌的初始接种量大致处于同一水平（100个孢子/孔），但观察到较大差异在增长潜力方面。毛霉菌株通常比青霉菌菌株生长得更快，其中M.plumbeus 01180036是生长最快的分离株。M.circinelloides 01180023是第一个在大约10小时后达到稳定期的分离株，但达到的最高水平低于其他菌株。青霉属菌株中生长最快的分离株是青霉ISI3，其生长速度几乎与铅青霉菌株一样快。相比之下，P.roqueforti ISI4细胞相对于其他测试菌株表现出最慢的初始生长。
图2、(A)用含有P.roqueforti ISI4的0.5%麦芽提取物软琼脂覆盖的LAB培养物的抗真菌抑制评分示例。对照：没有抗真菌培养物的MRS琼脂，上面覆盖有霉菌；“+++”：强抑制；“++”：弱抑制；“+”：生长但产孢延迟；“-”：无抑制。(B)板对板系统。L.parabuchneri LPB02（上板）产生的挥发性化合物对MEA板（下图）上P.commune 01180002生长的抑制作用。在密闭室中，分别评估了P.commune 01180002在底部MEA板上的生长情况，顶部(b)上有L.parabuchneri LPB02板的MRS发酵物，顶部(a)上有对照板。
图3、13种霉菌在酸奶琼脂平板上的生长潜力，分别在5°C(A)、16°C(B)和25°C(C)下培养长达24天。通过将每个孢子悬浮液（20μL，1.0×10 5孢子/mL）点样在酸奶琼脂平板上一式三份来确定测试。条形代表三个重复的平均值的标准误差。四种毛霉菌株用虚线标记；九个青霉菌菌株，带有实线。虚线框中（B，C）的生长曲线被放大。
图4、13个霉菌分别对12种含有活细胞的LAB发酵液(A)、LAB无细胞发酵液(B)以及MRS中LAB培养物的挥发物(C)的敏感性。LAB菌株代码：LRH01、LRH05、LRH14、LRH16和LRH43为鼠李糖乳杆菌菌株，LP01、LP37和LP48植物乳杆菌菌株，LPC44和LPC46副干酪乳杆菌菌株，以及LPB02和LPB04 L.parabuchneri菌株。
图5、酸奶中植物乳杆菌LP37造成的锰消耗。如所示添加不同浓度的锰（0.001、0.01和0.1 mM）。将带有斑点青霉菌菌株和毛霉菌株（200个孢子/斑点）的平板在25°C下孵育5天。条形代表三个重复的平均值的标准误差。Bio-LP37表示培养物植物乳杆菌LP37。闭合符号表示青霉菌菌株；空心符号表示毛霉菌株。
总结
由于食物浪费和经济损失，乳制品的真菌腐败是一个主要问题，一些真菌代谢物还可能对人类健康产生不利影响。乳酸菌(LAB)的使用正在成为化学防腐剂的潜在清洁标签替代品。本研究的目标是表征从乳制品中分离出的一组霉菌（四种毛霉菌株和九种青霉菌菌株）在三种储存温度（5°C、16°C和25°C）下的生长潜力，然后研究这些霉菌对12种培养基的生长影响。使用Biosense微生物生长曲线监测系统在25°C下监测麦芽提取物肉汤中的真菌细胞生长和形态24小时。
使用oCelloScope检测系统实时监测霉菌的生长曲线，oCelloScope检测系统是一个基于自动光学检测系统的小型便携式平台。该方法可用于在三维菌丝网络形成之前早期检测生长情况。还在不同温度下孵育的酸奶琼脂平板上进行了生长跟踪，其中选择5°C模拟冷藏温度、16°C滥用冷链温度和25°C室温。oCelloScope测试和酸奶琼脂斑点测试的结果非常一致。在测试的霉菌中，毛霉01180036是生长最快的，而青霉菌ISI4(P.roqueforti ISI4)是生长最慢的。在酸奶琼脂平板上，所有霉菌都在5°C、16°C和25°C下以温度依赖性方式生长，无论温度如何，毛霉菌株都比青霉菌菌株生长得更快。使用高通量叠加方法测试了对12种LAB培养物的敏感性，其中除P.roqueforti ISI4之外的所有霉菌均受到强烈抑制。当在含有LAB菌株活细胞的琼脂平板上发现霉菌孢子时，这些LAB的抗真菌作用得到了证实。与酸奶血清中的单一培养物相比，一些LAB二元组合提高了针对多种霉菌生长的抗真菌活性。对六种青霉菌和两种毛霉菌株的可能抗真菌机制进行了检查，因为锰耗尽导致的竞争排斥作用。本研究表明，除了未抑制的P.roqueforti ISI4之外，这种机制是测试霉菌的主要抑制因素，因为添加锰浓度增加至0.1 mM导致酸奶中霉菌生长部分或完全恢复。这些发现有助于了解影响乳制品霉菌腐败的参数以及污染菌株、底物和生物保护性实验室培养物之间的相互作用。
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