细菌是所有生物中数量最多的一类，它是最为常见的一种病原体，可引起许多严重疾病的爆发[1-2]，如肺结核、淋病、梅毒、鼠疫等。抗菌材料是指通过一定工艺，将抗菌剂添加到基体材料中制备成的具有杀灭和抑制微生物生长的一类新型功能材料[3]，该材料在医疗卫生、家庭用品、家用电器、食品包装等领域有极其广阔的应用前景。在人们对环境卫生要求日益提高的今天，抗菌材料的应用受到更加广泛的关注。

图1 Cu2-xSe NCs抗菌活性示意图

对病原微生物有杀死或抑制生长作用的抗菌剂是抗菌材料的核心部分，它可分为无机抗菌剂、有机抗菌剂和天然抗菌剂[4]。其中，无机抗菌剂一般利用银、铜、锌等金属自身的抗菌能力而制成抗菌剂[5]，其耐热性较好且抗菌广谱；有机抗菌剂主要为香草醛或乙基香草醛类化合物[6]，但耐热性较差，容易水解，且有效期短；天然抗菌剂主要来源于天然植物的提取，这也导致其数量较少且不能广谱抗菌。纳米技术的快速发展提供了用纳米材料控制病原微生物的可能和机会，由于其具有独特的化学和物理性质，现今已成为新型抗菌剂[7-8]。与银相比，铜的价格更低廉，且对各种细菌菌株具有优异的抗菌活性，因此铜基纳米材料越来越受欢迎。革兰氏阴性菌大肠杆菌和革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌对铜基纳米颗粒特别敏感，因此可用于治疗烧伤、手术伤口和糖尿病足溃疡感染[9]。作为抗菌剂，硫属铜化物拥有耐热性好、毒性低的优点，且可广谱持续抗菌[10]。基于硫属铜化物的这些特点，本实验利用硫属铜化物的重要代表之一的硒化铜纳米晶体(Cu2-xSe NCs)进行广谱抗菌。我们以常见的E.coli(革兰氏阴性菌)和S.aurues(革兰氏阳性菌)为模型菌株(图1)，通过测定细菌存活率、细菌生长曲线和杀菌曲线，纳米材料的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)，以及杀菌动力学来评价Cu2-xSe NCs的抗菌性能。实验结果显示，Cu2-xSe NCs对大肠杆菌及其耐药菌株的MIC均为32μg/mL，而对金黄色葡萄球菌及其耐药菌株的MIC则为4μg/mL，这是由于大肠杆菌具有双层膜而金黄色葡萄球菌仅有单层膜。此外，仅需32μg/mL Cu2-xSe NCs就可在1 h内杀死所有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，证明了Cu2-xSe NCs拥有良好的抗菌性能。

1实验部分

1.1实验仪器

细菌实验使用的所有玻璃器皿、试剂和材料均用LDZX-40SBI蒸汽压力灭菌锅(上海申安医疗器械厂)进行高温灭菌；所有细菌实验均在SW-CJ-IF(苏净集团安泰公司)洁净工作台上进行；细菌培养均在型号为QYC211 INCUBATOR SHAKER的全温空气摇床(上海福玛实验设备有限公司)中进行；Biotek多功能酶标仪Synergy H1(美国)用于测定细菌的OD600；实验所用细菌菌种均在-80℃的冰箱中保存，接种和纯化后的细菌均在0℃的冰箱中保存。

1.2实验试剂及材料

合成Cu2-xSe NCs所用的十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)和CuSO4·5H2O(99%)从国药化学试剂(上海)有限公司购买。SeO2(99.9%)购自阿拉丁化学(上海)有限公司。维生素C(VC)购自Alfa Aesar Co.Ltd(美国)。配制细菌Luria-Bertani(LB)培养基所用酵母提取物来自拜尔迪生物(OXOID)公司，蛋白胨来自北京奥博星生物技术有限公司，NaCl(分析纯)来自成都市科龙化工试剂厂，琼脂粉来自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。实验中其他溶剂均为分析纯，水为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

实验菌种大肠杆菌(Escherichiacoli,E.coli,ATCC 25922)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus,ATCC 25923)、大肠杆菌耐药菌(L339)、金黄色葡萄球菌耐药株(L393)均由西南医院检验科提供。

1.3硒化铜纳米晶体的制备

本文采用温和的室温水相法合成Cu2-xSe NCs。具体方法参照Lie等的合成原理[11]并略有改进。将800μL 30 mmol/L CTAB和2.4 mL H2O加入圆底烧瓶中，在剧烈搅拌下，依次加入50μL 0.2 mol/L SeO2和300μL 0.2 mol/L VC。反应10 min后，加入50μL 0.4 mol/L CuSO4·5H2O和400μL 0.2 mol/L VC。剧烈搅拌混合溶液，在30℃下反应1.5 h，并将混合溶液用10 kDa透析袋透析纯化24 h以去除小分子，然后再离心去除大分子。将合成的等离子体Cu2-xSe NCs储存在4℃冰箱，待用。

1.4培养基的配制

按照每1 L培养液中含5 g酵母提取液、10 g蛋白胨、10 g NaCl、15 g琼脂的比例配制LB固体培养基，并按照每200 mL培养液中含1 g酵母提取液、2 g蛋白胨、2 g NaCl的比例配制LB液体培养基。将制备的培养基放入锥形瓶中，摇晃均匀，并配制50 mL含0.9%NaCl溶液备用。将抑菌实验使用的培养皿、试管(试管上端用棉花堵住)、移液枪枪头、EP管(微量离心管)，以及加入培养液的锥形瓶、加入NaCl溶液的广口瓶、接纯水的广口瓶用报纸包好，在高温灭菌锅中于120℃灭菌30 min。待灭菌锅降温至60℃左右时取出所有物品，并轻轻摇晃锥形瓶中的培养液使其混合均匀，待没有气泡后将其倒入培养皿中使其自然冷却凝固，用保鲜膜包裹后放入4℃的冰箱中待用。上述过程均在无菌操作台上进行，且无菌操作台必须提前打开紫外灯杀菌30 min，倾倒培养液和自然冷却的过程需一直通风确保没有杂菌。

1.5标准菌株细菌悬液的配制

于-80℃冰箱中取出标准菌株，将接菌环置于酒精灯上直至烧红，冷却后用接菌环沾取菌液在培养基上轻轻平行地画线，梯度稀释三次。将画好线的培养基置于全温空气摇床中进行细菌的一代活化，时间为12 h。取出一代活化的细菌，重复接菌的步骤，挑取单菌落，将其放入全温空气摇床，在37℃下孵育12 h进行细菌的二代活化。测其OD值，当OD在0.6～0.8，表明细菌处于旺盛生长的对数生长期。

向试管中加入1 mL 0.9%NaCl溶液，将接菌环置于酒精灯上直至烧红，冷却后用接菌环挑取单菌落，并将其放入试管中，让细菌分散于NaCl溶液中，此时溶液将变得浑浊。采用BaSO4比浊法，制得浓度为1.0×108CFU/mL(CFU：菌落形成单位)的细菌悬液。以下抑菌实验所用的细菌悬液均在此基础上稀释了100倍，即细菌悬液的浓度均为1.0×106CFU/mL。以上步骤均在无菌操作台上进行。

1.6细菌存活率的测定

取100μL浓度为1.0×106CFU/mL的细菌悬液，100μL不同浓度的Cu2-xSe NCs溶液和800μL LB液体培养基加入已灭菌的试管，混合均匀后放入恒温摇床，在37℃、120 r/min下孵育24 h。用酶标仪测其OD600值并计算细菌的存活率。

1.7最小抑菌浓度和最小杀菌浓度的测定

最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)是描述药物抗菌活性的主要定量参数，也是衡量抗菌试剂抑菌能力的重要指标。在本文中，我们使用液体培养基稀释法测定MIC和MBC。取一系列EP管并写上编号，采用二倍稀释法，依次加入100μL不同浓度的Cu2-xSe NCs溶液，再加入100μL 1.0×106CFU/mL细菌悬液和800μL LB液体培养基，混匀后置于37℃全温摇床孵育24 h。取出试管，观察各EP管的浑浊程度，第一个澄清透明的EP管所对应的浓度即为MIC。

将所有未生长细菌试管及MIC的前一个试管中的培养液取200μL转移到干净的固体LB培养基上，涂板并在37℃全温摇床中孵育12 h，观察细菌生长情况。如果培养基上有菌落出现，则说明该浓度只能抑制细菌生长而不能杀死细菌，若无菌落或只有少量菌落(小于5)出现则表明该浓度有杀菌效果。第一个无细菌生长的板所对应的浓度即为MBC。

1.8细菌生长曲线的测定

取一块96孔板进行该实验，向每孔中加入100μL溶液，该溶液为1.0×106CFU/mL细菌悬液和Cu2-xSe NCs的混合溶液。其中，对于E.coli，Cu2-xSe NCs的浓度依次为0、2、4、8、16、32μg/mL；对于S.aureus，Cu2-xSe NCs的浓度依次为0、0.5、1、2、4、8μg/mL。每个浓度做3个平行样，第4个孔为调零孔，该孔溶液为只含有相应浓度Cu2-xSe NCs的LB液体培养基，即为菌液存在。加好样后将其置于37℃恒温箱中孵育，并分别于0、1、2、4、6、8、12、16 h取出，摇匀后用酶标仪测定OD600。去除底物吸光度后，以孵育时间为横坐标，OD600值为纵坐标，绘制细菌的生长曲线。

1.9时间-杀菌曲线的测定

取100μL浓度为1.0×106CFU/mL的细菌悬液，100μL不同浓度的Cu2-xSe NCs溶液和800μL LB液体培养基加入已灭菌的试管。其中，Cu2-xSe NCs的浓度依次为0、0.5倍MIC、1倍MIC、2倍MIC、4倍MIC和8倍MIC，即对于E.coli，Cu2-xSe NCs的浓度依次为0、16、32、64、128、256μg/mL；而对于S.aureus，Cu2-xSe NCs的浓度依次为0、2、4、8、16、32μg/mL。每个浓度做3个平行样。加好样后将其置于37℃恒温箱中孵育，并分别于0、1、2、4、8、12 h取出，涂板后继续置于37℃恒温箱中孵育12 h，计算菌落数。以时间为横坐标，菌落数为纵坐标，绘制时间-杀菌曲线。

1.10硒化铜纳米晶体中铜离子的释放

取一定量的Cu2-xSe NCs装入10 kDa透析袋中，并将其放入500 mL超纯水中，在室温下搅拌透析。分别于1、2、4、6、8、12、24 h用原子吸收光谱仪测定透析袋外液中Cu2+的浓度并绘制Cu2+释放曲线。

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