我国国内流行的D型流感病毒株HY11生物学特性鉴定
流感病毒分为A、B、C、D四个亚型。D型流感病毒(InfluenzaD virus,IDV)是近年来新发现的一种流感病毒类型。研究表明，IDV在牛群中引发轻度至中度呼吸系统疾病，病毒可以同时在牛的上下呼吸道中进行复制。流行病学研究显示，IDV在北美、欧洲、亚洲、非洲等国家均有流行。牛被认为是IDV的自然宿主。血清学研究表明，养殖厂从业人员血清中可以检测到IDV的抗体存在，显示其可能感染人。但是还没有分离到活病毒粒子。因此，分离并鉴定出D型流感病毒对流感病毒的研究具有重要意义。
疫苗是防控流感病毒感染和传播最有效的手段。流感病毒灭活疫苗应用最为普遍。IDV是引起牛呼吸系统疾病综合征的重要关联因子，对养殖业有潜在严重危害。目前国内尚没有相关疫苗用于养殖动物预防该病的研究。因此，开展流行病学调查，选择我国国内流行的D型流感病毒株，制备可以保证免疫及保护效果的灭活疫苗是非常必要的。
2D型流感病毒生物学特性鉴定
(1)透射电镜观察
电镜下所见病毒粒子呈球状，其表面有纤突，病毒颗粒大小(100-120nm)和形态符合流感病毒的典型特征。
(2)间接免疫荧光
为了进一步证明从牛身上分离的病毒能够在细胞培养物中复制，通过免疫荧光分析来证实。然而，目前还没有针对IDV的商用抗体，因此定制了一种针对D/bovine/Oklahoma/660/2013株原型的核蛋白(NP)的定制抗体(北京义翘神州科技股份有限公司，货号MF17MY2622)。之前文献报道已经证明了用于免疫荧光(IF)的NP-抗体的特异性(NP抗体Holwerda M,Kelly J,Laloli L,Stürmer I,Portmann J,Stalder H,DijkmanR.Determining the Replication Kinetics and Cellular Tropism of Influenza DVirus on Primary Well-Differentiated Human Airway EpithelialCells.Viruses.2019Apr24；11(4):377.doi:10.3390/v11040377.PMID:31022887；PMCID:PMC6521319.)。病毒感染48小时后，可检测到相当数量的病毒抗原阳性细胞。
(3)生长曲线
测定了第五代细胞毒株、鸡胚毒株以及噬斑纯化后斑块感染HRT-18G细胞毒株的病毒滴度，结果为105.25～106.25TCID50/mL左右。
研究了HY11毒株在HRT-18G(购自于美国模式培养物集存库，ATCC NO.CRL-11663)、MDCK(购自于武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0153)、MDBK(购自于武汉普诺赛生命科技有限公司，货号CL-0154)以及原代牛睾丸细胞(购自于北京博易汇科生物技术有限公司)的复制动力学，通过TCID50滴定了病毒在MDCK细胞中的病毒滴度。以0.1倍感染率(MOI)接种HRT-18G、MDCK、MDBK以及Bovine testicle cell细胞HY11株，在不同时间点(24、48、72和96小时)收集细胞培养上清。结果表明，分离出的HY11在这几种细胞中复制活跃，趋势相似，72小时后达到最高滴度。图1所示为间隔24小时的生长曲线。
(4)系统发育分析
使用MEGAXI对HEF基因片段的核苷酸序列进行了排列和分析，并进行了1000次引导重复。主要节点左侧的Bootstrap分数至少为70。IDV五个现存谱系(D/OK-、D/660-、D/Yama2016-、D/CA2019-和D/Yama2019--品系)的每个分支分别用蓝色、橙色、紫色、绿色和红色标出。本研究中描述的菌株(D/bovine/Jilin/HY11/2023,D/bovine/Jilin/HY15/2023and D/bovine/Jilin/HY19/2023)用星号标记。在中国发现的菌株加粗标出，结果如图2所示。
结论
D型流感病毒的保藏名称为D/bovine/Jilin/HY11/2023，拉丁名为Influenza D virus，于2024年01月05日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO：45769。电镜下观察到流感病毒样粒子，间接免疫荧光实验证明其是D型流感病毒株。通过荧光分子进化树分析显示该毒株是中国流行株，目前已获得其全基因序列，同时测定了其在细胞上的生长曲线，显示其可以在细胞上生长良好，此外，HY11可以在鸡胚中进行高滴度的增殖，为研制D型流感病毒灭活疫苗提供了基础。HY11培养后经灭活、浓缩、纯化，免疫豚鼠后可以产生高滴度的抗体，抵抗D型流感病毒野毒株的攻击，可以有效预防D型流感病毒。
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