适用于贵州贞丰地区的发酵床微生物菌剂生长曲线
发酵床技术从2004年从日本引进到国内，从原先单一菌剂发酵床到复合菌剂发酵床的开发应用，使得发酵床技术逐步稳定成熟。发酵床菌剂应用广泛，在用于制作发酵床方面，可以达到分解动物粪便的目的，从而增加效益、减少污染等。
贵州地处喀斯特地貌，多气候的特殊环境，微生物菌剂在贵州产酶、产孢等能力减弱。此外，贵州不同地区环境气候等差异较大，同一株微生物在不同地区的繁殖代谢能力也不一样。
目前，现有的发酵床菌种在贵州地区的应用存在以下缺陷：
1.现有发酵床菌种复合配方同质化严重，并且在贵州的实际表现能力较差，死床率高等。
2.现有发酵床菌种成本高，效果不佳，应用时间短。
为此，下面一种适用于贵州贞丰地区的发酵床菌剂及制备方法，以解决上述问题。
在贞丰地区采集土著微生物，并在实验室分离培养发酵床核心菌群，对核心菌群的生长曲线，代谢酶浓度测定评估，组合形成适用于贵州贞丰地区的发酵床菌剂配方。涉及的菌种及配方能较高适宜贞丰地区发酵床应用及持续稳定运营。
菌种保藏
芽孢杆菌：拉丁学名为Bac i l l us sp.，保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63150。
乳球菌：拉丁学名为：Lactococcus sp.，保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63149。
植物乳杆菌：拉丁学名为：Lact i p l ant i bac i l l us p l antarum，保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63152。
酵母菌：拉丁学名为Saccharomyces sp.，保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63151。
屎肠球菌，拉丁学名为Enterococcus faec i um，保藏于中国广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC NO：63145。
乳球菌的生长曲线图；
芽孢杆菌的生长曲线图；
酵母菌的生长曲线图；
屎肠球菌的生长曲线图；
适用于贵州贞丰地区的发酵床菌剂及制备步骤：
1)、采样：将7分熟的米饭装入采样木盒中，滴上6-7mL营养液，放入贞丰长田镇甘田村深山内，挖坑将培养盒放入，用腐殖土和白色菌丝体土壤覆盖，并在四周挖排水沟，防止水直接进入培养土坑中，7日后返回收集样本。
2)、样品前处理：用1:1甘油保存液将部分样本进行保种；取1mL液体，用9mL生理盐水稀释，记住10-1浓度，以此方法逐级稀释至10-5、10-6浓度，选用肉汤培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基进行初筛，将10-5、10-6浓度的稀释液各取1mL涂布于肉汤培养基和马铃薯葡萄糖琼脂培养基中，36℃培养72h。
3)、培养基配制：肉汤琼脂培养基(牛肉粉5g、蛋白胨20g、氯化钠5g、琼脂15g、水1000mL、pH7.0～7.2),马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g、琼脂15g、水1000mL)，屎肠球菌选择性培养基(月示胨10g，麦芽糖10g，酵母粉10g，甘油磷酸钠10g，氯化钠5g，乳糖1g，溴甲酚紫0.015g，叠氮钠0.4g，TCC 0.1g，琼脂13g)，LB琼脂胨培养基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g、氯化钠10g、琼脂15g、水1000mL、pH6.9～7.1)、MRS琼脂培养基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、吐温80 1g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、琼脂15g、水1000mL、pH6.0～6.4)，酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基(YPD琼脂培养基：蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、琼脂15g、水1000mL、pH6.3～6.7)，LB液体胨培养基(胰蛋白胨10g，酵母浸粉5g、氯化钠10g、水1000mL、pH6.9～7.1)、MRS液体培养基(胰酪胨10g、牛肉膏粉5g、酵母粉4g、葡萄糖20g、乙酸钠5g、柠檬酸三胺2g、吐温80 1g、磷酸二氢钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、水1000mL、pH6.2～6.4)，酵母浸出粉胨葡萄糖液体培养基(YPD液体培养基：蛋白胨20g、葡萄糖20g、酵母浸粉10g、水1000mL、pH6.3～6.7)。
4)、菌种复筛：初筛菌种培养结束后，从肉汤培养基上选取1-2株菌落分别在MRS琼脂、LB琼脂、屎肠球菌选择性培养基上进行涂布，38℃培养72h；从PDA琼脂培养基上选取形态结构较大菌落在YPD琼脂培养基涂布，30℃培养7d。
5)、菌种鉴定检测：从4组培养基中分离出的菌种通过析泽生物Z200菌落计数器进行菌落形态分析，结合菌种生长形态结构初判菌种种类；其次将菌泥使用革兰氏染液染色后进行镜检；无法判断的菌种再培养后送往苏州帕米诺克生物公司测序鉴定。
6)、菌种生长曲线检测：将分离纯化的菌种按照5％的菌液接种量接种到对应液体培养基中，每隔1h取样5mL，利用普析T6紫外分光光度计在620nm测定菌种OD值。
7)、产品对照实验：采购某品牌发酵床菌剂10kg，取1g菌粉置于肉汤培养基中进行培养，38℃培养72h；分离纯化贵州地区菌种主要为芽孢杆菌、乳球菌、植物乳杆菌、屎肠球菌、酵母菌等，将分离纯化菌种在对应培养基中进行扩繁培养，培养结束后使用卢湘仪18M离心机离心，将离心菌泥与保护剂1:1混合后使用四环福瑞0.05平方实验室小型冻干机冻干32h，冻干后的单菌粉其复合比例为4:1:1:2:2，将复合后的复合菌粉1g也置于肉汤培养基中38℃培养72h。将培养好的菌液测定其活菌数、pH、淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶。
8)、贞丰地区验证实验：将市场产品和复合好的贞丰地区菌种产品都按1:5与玉米面混合撒匀在甘田村发酵床上进行产品临床实验，每月进行1次采样，采样后测定活菌数、pH、酶活等。
结果表明：乳球菌在48h时达到最大峰值，芽孢杆菌和酵母菌在20-30h之间达到峰值，生产繁殖情况较市场购买菌种优异。