传统腌干鱼制品中降解生物胺菌株的筛选、生长曲线及影响因素（一）
为获得用于咸鱼等腌制水产品的生物胺降解菌，本文采用生物胺初筛培养基与高效液相色谱技术分析，研究从传统方法加工的咸鱼中分离筛选具有降解生物胺的菌株，通过VITEK 2鉴定系统进行菌种鉴定，并分析菌株的生长曲线、降解生物胺动力学、温度、pH、盐度、生物胺底物浓度等特性，及在咸鱼中接种菌株对产品生物胺的影响。结果表明:从咸鱼中分离筛选到三株具有降解生物胺的菌株，分别是鼠李糖乳酸菌(Lactobacillusrhamnosus，Lr)、植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum，Lp)、戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus，Pp);对生物胺降解的最适温度为30～35℃，最适pH为5.5～6.0，对食盐有较好的耐受性，在食盐浓度≤80 g/L时对生物胺的降解作用尤为明显，Lr与Lp之间无拮抗作用;接种了生物胺降解菌的咸鱼产品中腐胺、尸胺、组胺、酪胺等生物胺含量均显著性降低(p<0.05)，而接种Lr∶Lp=1∶2的混合菌种的咸鱼产品生物胺含量下降幅度最大。
腌制咸鱼是一种风味独特的传统水产品，深受广大消费者的喜爱。其传统生产工艺属自然发酵，发酵过程微生物种类复杂，产品的品质和安全性难以得到保证。生物胺普遍存在于蛋白质含量丰富的发酵食品中，如发酵香肠、干酪、咸鱼、鱼露等。当其在人体内积累到较高数量时就会出现一些诸如头痛、恶心、痉挛等一系列中毒性状，严重的甚至会危及生命。生物胺含量是微生物分泌的氨基酸脱羧酶和生物胺氧化酶共同作用的结果，即脱羧酶催化氨基酸脱羧基，产生并积累生物胺，生物胺氧化酶则氧化并降解生物胺。
长期以来，研究人员一直在尝试开发能有效控制生物胺的方法，大部分都是通过抑制食品中生物胺产生菌的数量或氨基酸脱羧酶的活性来减少生物胺的产生，如辐照、低温贮藏、真空包装等，这些方法在一定程度上可以减少生物胺的产生，但不能消除已产生的生物胺。近年来，具有胺氧化酶的微生物成为研究热点，通过接种无氨基酸脱羧酶或含生物胺氧化酶的微生物制剂，使其在发酵过程中成为优势菌，从而降解生物胺或抑制生物胺的生成。目前国内外对乳酸菌降解生物胺开展了相关研究。马宇霞等从熏马肠中分离鉴定了6株生物胺氧化酶菌株，其中包括鼠李糖乳酸菌、戊糖片球菌和植物乳杆菌三株乳酸菌;Tosukhowong等研究了植物乳杆菌BCC 9546作为一种降解菌对发酵香肠中生物胺的降解作用;Nie等报道了银鱼香肠接种植物乳杆菌后会对其生物胺产生影响。
目前有关乳酸菌的降解特性还未见文献报道，因此，本实验室从传统腌干鱼制品中分离筛选具有生物胺降解活性的微生物，为腌干鱼加工过程中发酵剂的选择提供菌种来源，提高其可食用安全性，并探讨温度、pH、食盐浓度和生物胺底物浓度对生物胺降解的影响，为生物胺的控制研究提供理论依据，并为腌干鱼的工艺革新提供参考。
1材料与方法
1.1材料与仪器
咸鱼传统法腌制，实验室自制;生物胺标准品:腐胺(PUT)(≥98%)、尸胺(CAD)(≥95%)、组胺(HIS)(≥99%)、酪胺(TYR)(≥99%)均购自美国Sigma公司;乙腈(色谱纯)、丹磺酰氯(Dns-Cl，≥99%)、甲醇(色谱纯)均购自上海安谱科学仪器有限公司;丙酮(色谱纯)购自美国Burdick&Jackson公司;MRS培养基、MRS肉汤培养基均购自广东环凯微生物科技有限公司;其它化学试剂均为分析纯，购于广州粤升试剂公司;实验用水均为超纯水。
Agilent 1100高效液相色谱仪美国Agilent公司;立式蒸汽压力灭菌锅388型上海申安医疗器械厂;3K30冷冻离心机美国Sigma公司;SW-CJ-1FD超净工作台江苏苏净安泰公司;SPX-320生化培养箱宁波东南仪器厂;TU-1990紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司;T25高速均质机德国IKA公司;热泵除湿干燥箱上海一恒科技有限公司;VITEK 2 Compact菌种鉴定系统法国生物梅里埃公司。
1.2实验方法
1.2.1降解生物胺菌的筛选及鉴定在无菌条件下取咸鱼背部肌肉10 g，剪碎后放入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，混合均匀，用无菌生理盐水依次稀释为102、103、104倍，取1 mL上述不同浓度的稀释液涂布于MRS培养基中，然后置于30℃的恒温培养箱中培养48 h，挑单菌落以平板划线的方法多次纯化。将纯化后的单菌落分别接入到改良型MRS肉汤培养基中，以不接种菌的培养基作对照，30℃培养48 h后取样，测定培养基中的生物胺含量。将具有生物胺降解活性的乳酸菌接种于3 mL无菌盐水(4.5 g/L NaCl，pH4.5～7.0)中，混匀，用比浊仪配制相当于0.80～0.10麦氏单位的菌悬液，使用VITEK 2全自动微生物分析系统进行菌种鉴定。
1.2.2生物胺降解菌的生长曲线测定
将乳酸菌活化后，以2%的接种量接入MRS肉汤培养基中，于30℃条件下培养，在48 h内每隔6 h取一定量的菌液，稀释到适宜倍数，测定OD600值。
1.2.3菌株对混合生物胺的降解动力学研究
将菌活化后，以2%的接种量分别接种于50 mL，pH为5.5的含四种生物胺(腐胺、尸胺、组胺和酪胺，浓度分别为100 mg/L)的MRS肉汤培养基中，分别置于30℃条件下恒温培养48 h，以未接种的培养基作空白对照，在48 h内每隔6 h取样检测实验组和对照组培养基中生物胺含量，根据公式1计算各生物胺的降解率，绘制菌株对混合生物胺的降解动力学曲线。
式(1)
式中:W0-对照组中生物胺的含量，mg/L;W1-实验组中生物胺的含量，mg/L。