不同碳源、氮源、培养温度、PH值对褐藻酸降解菌AGN12菌生长及产酶的影响
海带是我国产量最高的海藻类生物,富含褐藻酸盐(alginate)类多糖聚合物。褐藻酸降解菌能分泌褐藻酸酶,使褐藻酸多糖转化为具有多种生物活性的寡聚糖,诱导植物产生抗性反应并增强抵抗力。为此,从腐烂的海带汁中筛选和分离得到菌株AGN12,利用其体内的酶水解褐藻酸盐,采用单因素试验研究其生长条件和产酶条件,旨在为利用酶法降解褐藻酸多糖生成有活性的寡糖提供工艺参数。
1材料与方法
1.1原料与试剂
将新鲜海带破碎后,置于三角瓶中发酵数天,得腐烂海带汁,通过发酵、富集、培养、选择、分离得到AGN12菌。
碳源为褐藻酸,产自上海埃彼化学试剂有限公司;氮源为蛋白胨和酵母浸粉,产自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司;硫酸铵产自上海埃彼化学试剂有限公司。
1.2试验方法
1.2.1不同碳源对生长和产酶的影响在基础培养基的基础上调整碳源,即分别添加浓度均为0.6%的葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、海藻酸、微晶纤维素、果糖、甘露糖和山梨糖,配制含有不同含碳化合物的培养基。然后按3%的接种量接入菌液,于30℃液体培养16 h后,测定发酵液的生物量和上清液的酶活力。
1.2.2不同氮源对生长和产酶的影响在含0.6%褐藻酸基础培养基的基础上调整氮源,分别添加浓度均为0.2%的酵母浸粉、蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、尿素、酪蛋白水解物、硝酸铵和硫酸铵,配制含有不同含氮化合物的培养基。按3%的接种量接入菌液,于30℃液体培养16 h后,测定发酵液的生物量和上清液酶活力。
1.2.3培养温度对生长和产酶的影响按3%的接种量接入基础培养基中,分别在20,25,30,35℃下液体培养16 h,测定发酵液的生物量和上清液酶活力。
1.2.4培养基初始pH值对生长和产酶的影响将生长基础培养基的起始pH分别调至3.0,5.0,7.0,8.0,9.0,11.0。然后按3%的接种量接入菌液,30℃液体培养16 h,测定发酵液的生物量并测定上清液的酶活力。
1.2.5培养时间对生长和产酶的影响在上述最佳产酶条件下,按3%的接种量培养菌体,前24 h内每隔2 h取样,24 h后每隔12 h取样,测定发酵液的生物量和酶活,确定最佳发酵时间。
2结果与讨论
2.1不同碳源对生长及产酶的影响
不同碳源对AGN12菌生长及产酶的影响见表1。
由表1可知:AGN12菌对不同碳源的利用有很大差别,以海藻酸作为碳源时,菌体生长最好,酶活力最高,即产酶量最高;用酵母浸粉、甘露糖、葡萄糖、麦芽糖、果糖做碳源时,菌体生长缓慢,产酶量也较低,说明AGN12菌对这几种碳源的利用效果不好;以山梨糖、CMC、可溶性淀粉、蔗糖为碳源时,菌体不生长,也检测不到酶活。由此可以得出结论,海藻酸钠是最佳碳源。
2.2不同氮源对生长及产酶的影响
不同氮源对AGN12菌生长及产酶的影响见表2。
由表2可见:在含有机氮源牛肉膏、胰蛋白胨、酪蛋白水解物的培养基中,AGN12菌能迅速生长并具有较高的产酶能力;在含蛋白胨、酵母浸粉的培養基中,AGN12菌也能迅速生长并具有一定的产酶能力;在含有无机氮源硫酸铵、硝酸铵的培养基中,AGN12菌的生长情况不及含有机氮源的培养基,但以硫铵为氮源时,AGN12菌具有很高的产酶能力。从空白来看,AGN12菌在不含任何氮源的培养基中能迅速生长并有较高的产酶能力。将空白与含有机氮源培养基培养产酶情况相比较,发现部分有机氮源抑制菌产酶。
2.3培养温度对生长和产酶的影响
受试验条件限制,仅选择20,25,30,35℃共4个温度进行试验,结果见图1。
由图1可知,从20℃开始,随着温度的升高,细菌生长情况良好,酶活不断增强。测裂解酶酶活即粘度发现,20℃和25℃的产酶情况相差不大,而另一酶活指标还原糖生成量随温度升高不断升高;30℃是生长和产酶的最佳温度,菌体生长迅速,生物量和产酶量达到最高。但温度升高到35℃时,菌开始停止生长。
2.4培养基初始pH值对生长和产酶的影响
将培养基的初始pH调整为3.0,5.0,7.0,8.0,9.0,11.0,初始pH值对生长和产酶的影响见图2。
由图2可以看出:在pH 8.0的培养基中,菌体长最好,产酶量最高,其次为pH 7.0的培养基。由此确定培养基最适初始pH值为8.0。
2.5培养时间对生长和产酶的影响
培养时间对生长和产酶的影响见图3。
在前6 h里,菌体处于延滞期;6~22 h,菌体生长迅速,表明菌体处在对数期,并在24 h时菌体浓度达最大值,OD600为1.004(稀释二倍);此后,菌体生长变慢,处于稳定期;在26 h后菌体开始自溶,浓度不断下降。
从还原糖浓度变化来看:发酵液中的酶活力逐渐升高,在24 h达到最高;此后菌体量开始下降,酶活力在24~72 h之间呈稳定状态,72 h后呈现下降趋势。故24 h为最佳培养时间。
3结论
以菌株AGN12为试验对象,以碳源、氮源、培养时间、培养基初始pH值、培养温度等为因素,研究褐藻酸降解菌的最佳生长及产酶条件。通过单因素试验确定AGN12菌生长及产酶的最佳条件为:以0.7%海藻酸钠为碳源,以0.3%硫酸铵为氮源,培养温度30℃,培养基初始pH值8.0,培养时间24 h。
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