临床微生物实验室药敏试验三种扩散法的具体操作及试验结果(一)
药敏试验是指细菌对抗菌药物的敏感性试验,通过药敏试验,能很好地掌握药物对细菌的敏感性,为临床选用抗菌药物提供理论参考,以便准确有效地利用药物进行预防治疗。常用方法有纸片法、牛津杯法和打孔法等。通过对大肠杆菌的药敏试验,氧氟沙星、氟甲喹、新霉素为高敏,硫氰酸红霉素、林可霉素为中敏。
抗菌药对细菌性传染病的预防、控制起到非常重要的作用,但因盲目、滥用抗菌药,致使很多致病性细菌产生了耐药性,使得抗菌药对细菌性疾病的控制效果越来越差,不但造成药物浪费,而且还延误病情,给养殖场(户)造成了很大的经济损失,给养殖业带来很大的困惑。通过药敏试验,能很好地掌握药物对细菌的敏感性,为临床选用抗菌药物提供理论参考,以便准确有效的利用药物进行预防治疗。笔者从事实验工作30年,临床微生物实验室进行药敏试验的方法主要是扩散法,现将三种扩散法的具体操作及试验结果介绍总结如下,供大家临床用药参考。
1材料和方法
1.1原理
药物在琼脂中扩散,随着扩散距离的增加,抗菌药物的浓度呈对数减少,从而形成浓度梯度,由于抑菌浓度范围内的菌株不能生长,而抑菌范围外的菌株则可以生长,从而形成透明的抑菌圈,抑菌圈的大小可以反映测试菌对药物的敏感程度,并与该药物对测试菌的MIC(最小抑菌浓度)呈负相关。
1.2材料
1.2.1菌种
临床现场采取大肠。
1.2.2抗生素和抗菌药
选用氧氟沙星可溶性粉(编号为1)、硫氰酸红霉素可溶性粉(编号为2)、盐酸林可霉素可溶性粉(编号为3)、氟甲喹可溶性粉(编号为4)、硫酸新霉素可溶性粉(编号为5)5种抗菌药进行对比试验。
1.3方法
1.3.1纸片法
将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上。
1.3.1.1纸片制备
取定性滤纸,用打孔机打成6 mm直径的圆形小纸片。取圆纸片200片分5份分别装入清洁干燥的5个青霉素空瓶中,瓶口以报纸包扎。经15磅15~2 min高压消毒后,放在37℃温箱或烘箱中数天,使完全干燥备用。
1.3.1.2药液的制备(用于商品药的试验)
挑选可溶性粉剂氧氟沙星(编号为1)、硫氰酸红霉素(编号为2)、林可霉素(编号为3)、氟甲喹(编号为4)、新霉素(编号为5),按商品药治疗量的10倍的比例配制药液。
1.3.1.3药敏片的准备
在上述含有40片纸片的5个青霉素瓶内分别加入氧氟沙星可溶性粉(编号为1)、硫氰酸红霉素可溶性粉(编号为2)、盐酸林可霉素可溶性粉(编号为3)、氟甲喹可溶性粉(编号为4)、硫酸新霉素可溶性粉(编号为5)的0.1%药液10 ml,并翻动纸片,使各纸片充分浸透药液。翻动纸片时不能将纸片捣烂,同时在瓶口上记录药物名称,放37℃温箱内过夜,干燥后即密盖。切勿受潮,置阴暗干燥处存放,有效期3~6个月。
1.3.1.4普通营养琼脂培养基
称取琼脂培养基22.5 g,加入500 ml蒸馏水中,加热煮沸溶解,培养皿分装,在培养皿的皿底划十字形,标号(与抗菌药物编号一致),消毒,备用。
1.3.1.5菌种的挑选、培养
将临床症状和剖检变化疑似大肠杆菌病的鸡或猪的肝、脾、心脏,先用灼烧的手术剪在肝或心脏表面烙烫一下,剪取病料如肝、脾、心脏剪小块直接放入肉汤培养基中,置于37℃恒温箱中培养24 h进行培养,备用。
1.3.1.6操作步骤
第1步,在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的镊子夹取消毒棉,蘸取待检细菌混悬液,涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密,涂好的培养皿放入37℃恒温箱中20~30 min,效果更好。
第2步,将消毒镊子夹取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴,可用镊子轻按几下药敏片。药敏片有规律地贴于平皿培养基上,每种药敏片要与相应的编号对应,每组重复3次,结果取平均值。
第3步,将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后,观察效果。
1.3.2牛津杯法
在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的镊子夹取消毒棉,蘸取待检细菌混悬液,涂布于平皿培养基表面。操作、要求同纸片法。
无菌操作将灭菌的不锈钢小管(内径6 mm、外径8 mm、高10 mm的圆形小管,管的两端要光滑,也可用塑料管、玻璃管、瓷管代替),放置在培养基上,轻轻加压,使其与培养基接触无空隙。
15 min后分别向各小管中滴加和药敏片一样量(25μL)的各种药液,每组重复3次,结果取平均值。
将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后,观察效果。
1.3.3打孔法
在“超净台”中,用经(酒精灯)火焰灭菌的镊子夹取消毒棉,蘸取待检细菌混悬液,涂布于平皿培养基表面。操作、要求同纸片法。
无菌操作将灭菌的不锈钢小管(外径为4 mm、孔径与孔距均为3 mm,管的两端要光滑,也可用塑料管、玻璃管、瓷管),放置在培养基上打孔,将孔中的培养基用针头挑出,并以火焰封底,使培养基能充分的与平皿融合(以防药液渗漏,影响结果)。
待15 min后,分别向各孔中滴加和药敏片一样量(25μL)的各种药液。每组重复3次,结果取平均值。
将平皿培养基置于37℃温箱中培养24 h后,观察效果。
1.3.4判定标准
药敏试验的结果,应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。
表1药物敏感试验判定标准
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