利用细菌生长曲线表征芳樟醇对三文鱼莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果（二）
2结果与分析
2.1α多样性分析结果
对单样本的α多样性分析可以反映样本内的微生物群落的丰富度和多样性。由表1可知，5个样品的微生物覆盖率（Coverage）均为1.000，说明该测序结果鉴定了三文鱼片中绝大多数细菌的系统类别。检测结果表明，从0～12 d的样品观察到的细菌OTUs数量分别为121、104、125、135、128。以Shannon、Simpson、Chao1及Ace指数对样品的菌群丰富度和多样性进行初步评估。Shannon指数及Simpson指数用于估算样品中微生物的多样性，Shannon越大，群落多样性越高，Simpson指数则相反；而Chao1指数及Ace指数常用于估算样品的菌群丰度，是OTUs丰度的其他估计量。表中数据显示Shannon指数逐日增加，而Simpson指数则相反，说明样品的微生物多样性逐渐增多；而Chao1及ACE指数均高于每个相应样本的OTUs观察数则表明在所有样品中可能还存在一些额外的微生物门类。
表1不同贮藏时间三文鱼微生物群落的α多样性指数
基于OTUs分析制作三文鱼样品的Venn图，不同的椭圆代表不同组样品，重叠部分的数字代表样本间共有的OTUs个数，单独的数字代表样本特有OTUs个数。由图1可知，整个贮藏期间三文鱼OTUs总数为210个，其中5组样品共有的有56个，占总数的26.67%；第0天（S0d）OTUs数量为121个，占总数的57.62%；第3天（S3d）OTUs数量为104个，占总数的49.52%；第6天（S6d）OTUs数量为125个，占总数的59.52%；第9天（S9d）OTUs数量为135个，占总数的64.29%；第12天（S9d）OTUs数量为128个，占总数的60.95%。第0天特有的OTUs数量为10个，占总数的4.76%；第3天特有的OTUs数量为4个，占总数的1.90%；第6天特有的OTUs数量为10个，占4.76%；第9天特有的OTUs数量为11个，占总数的5.24%；第12天特有的OTUs数量为12个，占总数的5.71%。图中各椭圆均与其他组椭圆有重叠的部分，表明各组样品的细菌物种之间互有交叉，图1证明了在贮藏期间的三文鱼细菌群落是动态变化的。
图1三文鱼样品细菌群落Venn图
2.2细菌相对丰度分析结果
分别从门、纲、目、科、属、种6个水平对三文鱼4℃贮藏期间的细菌群落相对丰度进行分析，结果如图2所示。贮藏期间三文鱼的细菌优势菌门为变形菌门（Proteobacteria）；优势菌纲为γ-变形菌纲（Gammaproteobacteria）；优势菌目为弧菌目（Vibrionales）和假单胞菌目（Pseudomonadales）。在科水平的优势菌为弧菌科（Vibrionaceae）、假单胞菌科（Pseudomonadaceae）、伯克氏菌科（Burkholderiaceae）和莫拉菌科（Moraxellaceae）。
三文鱼4℃贮藏期间属水平的优势菌为发光杆菌属（Photobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、青枯菌属（Ralstonia）和不动杆菌属（Acinetobacter），相对丰度为97%，其中贮藏前期发光杆菌属的细菌在整个菌相系统中处于优势地位，相对丰度为84.89%；而随着时间的延长，假单胞菌属、青枯菌属、不动杆菌属的细菌相对丰度均呈现上升的趋势，其中假单胞菌属的细菌相对丰度上升趋势最为明显，在贮藏初期相对丰度为3.98%，到第12天时相对丰度高达31.46%，并且仍有上升的趋势。此外菌相系统中还存在一些如紫色杆菌属（Janthinobacterium）、希瓦氏菌属（Shewanella）等细菌。而在整个贮藏期间Pseudomonas fragi增长速度最快，在第0、3、6、9、12天相对丰度分别为3.01%、4.89%、11.20%、21.99%、24.82%。
图2三文鱼细菌群落不同分类水平的相对丰度
2.3优势腐败菌的分离鉴定结果
将1.3.2节分离、纯化后得到菌株进行DNA提取和PCR扩增，测定扩增产物的基因序列并与NCBI数据库中已知的微生物基因序列进行BLAST比对分析，构建系统发育树，选择与已知的微生物基因序列同源性最高且活性最强（活化培养至对数生长期时菌体浓度最高）的菌株，将其命名为MS 02。如图3所示，16S rRNA分析结果证明MS 02为莓实假单胞菌。后续实验均以莓实假单胞菌MS 02为靶细菌。
图3菌株MS 02与其他假单胞菌之间的系统发育树
2.4芳樟醇对莓实假单胞菌的抑菌活性
芳樟醇对水产品优势腐败菌——莓实假单胞菌的抑菌活性如表2所示。当芳樟醇质量浓度为1.00μg/mL时，莓实假单胞菌的OD595 nm为0.268±0.014，与阳性对照组无显著性差异（P＞0.05），但略高于阳性对照组，因此芳樟醇对莓实假单胞菌的MIC为2.00μg/mL。图4显示了芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02生长的影响，在细菌生长过程中，菌悬液中的细菌浓度与OD595 nm呈正相关，因此能够通过莓实假单胞菌OD595 nm表征细菌的生长状况。由图4可知，空白对照组莓实假单胞菌呈指数型增长，说明溶剂中的甲醇对细菌生长无明显影响。加入MIC和2 MIC的芳樟醇后，细菌生长明显受到抑制，MIC组的OD595 nm仅在培养后期有略微增长，可能是因为芳樟醇剂量较低，且培养时其易挥发导致的。
图4芳樟醇对莓实假单胞菌生长的影响
2.5莓实假单胞菌的微观形貌观察结果
采用芳樟醇处理后的莓实假单胞菌的微观形貌如图5所示，未添加芳樟醇的莓实假单胞菌（图5A）的菌体形态呈完整且表面光滑的杆状结构，当添加芳樟醇后，菌体表面随着芳樟醇添加量的增大出现不同程度的破裂，MIC和2 MIC芳樟醇处理的莓实假单胞菌如图5B、C所示，图5B中菌体表面变得粗糙且不完整，细胞膜产生明显的凹陷褶皱，图5C中的菌体形态被严重破坏，细胞膜几乎完全破裂，内容物溶出。上述结果表明芳樟醇能破坏莓实假单胞菌的细胞结构，导致细胞内容物外泄，从而抑制菌的生长。植物精油因具有疏水性更易作用于细菌细胞膜，破坏胞质膜结构，从而抑制细菌生长。
图5芳樟醇处理后的莓实假单胞菌SEM图
2.6芳樟醇对莓实假单胞菌电导率的影响
图6反映了芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02电导率的影响，当细菌细胞膜被抑菌剂损害时，细胞膜的半透性丧失，胞内电解质大量流出，抑制细菌生长。空白对照组菌液电导率变化不明显，这表明体系中的甲醇不会破坏细胞膜的通透性；加入MIC和2 MIC芳樟醇的菌液电导率迅速上升，表明芳樟醇对莓实假单胞菌的细胞膜有明显破坏作用，细胞膜破损、电解质流出导致菌液电导率的上升。
图6芳樟醇对莓实假单胞菌电导率的影响
2.7芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜通透性的影响
FDA是一种自身无荧光且不带电荷的脂质性分子，在胞内可被酶水解为荧光素发出荧光，当细胞膜受到破坏，荧光素流失从而导致FDA荧光强度降低。因此，细菌细胞膜的通透性可通过FDA荧光强度来反映。图7中显示的是相同处理时间不同处理条件的FDA荧光强度，50%甲醇处理的荧光强度为1 920 AU，MIC和2 MIC组的荧光强度分别为530、211 AU，可以看出添加芳樟醇的处理组其荧光强度明显低于对照组，这表明50%甲醇不能改变细菌细胞膜的通透性。但随着芳樟醇质量浓度增加，细菌细胞膜被破坏程度逐渐明显，2 MIC处理组的荧光强度最低，这表明2 MIC芳樟醇处理能明显破坏莓实假单胞菌的细胞膜，这与图5中2 MIC组菌体形态被严重破坏，细胞膜几乎完全破裂的结论一致。舒慧珍等在探究柠檬烯对荧光假单胞菌细胞膜通透性的影响时也得到了类似的结论。
图7芳樟醇对莓实假单胞菌FDA荧光强度的影响
2.7芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜完整性的影响
细胞膜的完整性是菌体正常生长代谢的重要影响因素，其受到破坏会导致膜内的DNA和RNA等物质泄漏，DNA和RNA在260 nm波长处具有强吸收作用，故可用菌悬液在OD260 nm的变化反映细菌细胞膜的完整性。如图8所示，在反应3 h后，含芳樟醇组菌悬液中的OD260 nm迅速升高，而空白对照组变化不明显，这与上文的结论相一致，说明PCL不会引起细菌细胞膜的破裂。MIC和2 MIC的芳樟醇会使莓实假单胞菌细胞膜在短时间内破裂，内容物迅速流失，对细菌细胞有较明显的破坏作用。张赟彬等发现肉桂醛会使大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜完整性被破坏，内容物迅速释放导致菌液在260 nm波长处的光密度值增大，本实验结果与其一致。
图8芳樟醇对莓实假单胞菌细胞膜完整性的影响
2.8芳樟醇对莓实假单胞菌胞内酶的影响
钠钾ATP酶是一种蛋白酶，存在于组织细胞及细胞器膜上，能维持跨膜离子浓度梯度，测定胞内钠钾ATP酶的活力变化可以分析抑菌剂对细菌细胞能量代谢的影响。由图9可知，在培养6 h后，空白对照组的钠钾ATP酶活力最大，而MIC和2 MIC芳樟醇组的钠钾ATP酶活力都相对较小，且明显可以看出芳樟醇添加量与胞内钠钾ATP酶活力有直接联系。这表明芳樟醇能有效抑制莓实假单胞菌细胞内钠钾ATP酶的活力，影响细胞的正常能量代谢。胡文杰等研究表明油樟叶精油的几种馏分单体也能使尖孢镰刀菌内ATP酶活力下降。
图9芳樟醇对莓实假单胞菌胞内酶活力的影响
AKP存在于细胞壁和细胞膜之间，一般难以在胞外被检测到，但当细胞结构被破坏后，AKP会泄漏至细胞外。因此，可通过检测细菌胞外的AKP活力变化来观察其对细胞壁的破坏情况。由图9可知，在培养6 h后，空白对照组AKP活力最高，说明50%甲醇对莓实假单胞菌的细胞壁结构无影响。但添加MIC和2 MIC芳樟醇后，莓实假单胞菌AKP活力降低，这表明芳樟醇的加入会使莓实假单胞菌的细胞壁被破坏，导致菌体电解质外泄，最终抑制菌体生长，且随着芳樟醇添加量的增加，AKP活力降低越明显。
3结论
本实验采用HTS分析4℃贮藏期间三文鱼的菌相结构，并分离提取出1株三文鱼优势腐败菌——莓实假单胞菌MS 02，再深入探究芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02的抑菌机理。4℃贮藏三文鱼的微生物群落多样性与演替规律会随着时间延长而变化。三文鱼的优势菌属为发光杆菌属、假单胞菌属、青枯菌属和不动杆菌属。贮藏期间三文鱼菌相发生极大地变化，各菌群之间相互竞争，假单胞菌属的相对丰度随着时间的延长逐渐增大，莓实假单胞菌是样品在贮藏期间的增长速率最快的菌种。芳樟醇对莓实假单胞菌MS 02具有良好的抑菌效果，SEM结果表明芳樟醇能使细菌细胞膜产生凹陷褶皱，而电导率、OD260 nm、FDA荧光强度和AKP、钠钾ATP酶活力结果则证明了芳樟醇能破坏莓实假单胞菌的细胞膜和细胞壁的通透性和完整性，影响细菌细胞正常能量代谢，导致菌体死亡。
利用细菌生长曲线表征芳樟醇对三文鱼莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果（一）
利用细菌生长曲线表征芳樟醇对三文鱼莓实假单胞菌MS 02的抑菌效果（二）