10种有机物对氧化亚铁硫杆菌BYM磁小体生长、合成、发酵、产量的影响（三）
3、讨论
A.ferrooxidans BYM在好氧条件下能够以培养基中的FeSO4为底物进行磁小体合成。随着研究的不断深入，发现这类细菌在一定程度上能够吸收特定有机物转化为细胞的生长物质，但是其同化能力有限[14]。研究发现，A.ferrooxidans BYM生长和磁小体合成受到培养基组分和培养条件的影响[28]。由于不同有机物可以调节亚铁转运，改变细胞膜通透性，从而达到促进A.ferrooxidans BYM生长的目的。因此，本研究以A.ferrooxidans BYM为目的菌株，分别添加10种不同浓度有机物，根据亚铁氧化速率判断不同浓度有机物对A.ferrooxidans BYM亚铁氧化的效果，为进一步探究A.ferrooxidans BYM磁小体的发酵奠定基础。
研究表明，不同浓度的柠檬酸可能影响A.ferrooxidans磁小体相关基因mpsA、feoB、tonB及mpsA的表达，推测其原因可能是由于柠檬酸能够螯合Fe3+，促进A.ferrooxidans对Fe3+的转运[29]。对A.ferrooxidans R2进行低分子量有机酸耐受试验，结果表明A.ferrooxidans R2可以耐受40 mmol/L的柠檬酸[30]。因此，本研究选择柠檬酸探究其对A.ferrooxidans BYM菌体生长的影响。酒石酸作为常见的金属螯合剂常用于重金属吸附，能够较好地吸附被污染土壤中的镍、铜、锌、镉和铅[31]。0.5 mmol/L抗坏血酸能够完全抑制A.ferrooxidans NCIM 5370中的过氧化氢酶活性[32]。其还原作用能够减少Fe3+的积累，加速铁的循环。因此推测，试验中添加l-抗坏血酸能够通过还原作用消耗A.ferrooxidans BYM代谢产生的Fe3+，同时减少活性氧和自由基对A.ferrooxidans BYM的损伤。苹果酸作为一种小分子量有机酸常用于金属生物浸出[33]。因此，本研究添加苹果酸，判断其对A.ferrooxidansBYM菌体生长的影响。在培养基中添加l-甘氨酸能够促进A.ferrooxidans CK浸出胶磷矿的效率，通过试验结果可知，l-甘氨酸的存在能够显著增强细菌在矿物表面的吸附作用[34]。葡萄糖酸作为铁螯合剂能够在一定程度上促进A.ferrooxidans ATCC 23270生长[35]。因此，本研究通过添加葡萄糖酸验证其对亚铁氧化的作用。10 mmol/L的吐温-80能够促进A.ferrooxidans ATCC 23270生长以及S0和CuFeS2的代谢，其能够改变A.ferrooxidans细胞表面多聚物[36]。Jafari等报道，10 mmol/L SDS会影响A.ferrooxidansATCC 23270生长，引起细胞膜损伤和矿物表面亲水性变化，抑制A.ferrooxidans亚铁氧化，降低铜浸出率[37]。由于SDS对A.ferrooxidans的强抑制作用，即使将SDS浓度降低至0.001 mmol/L，其仍能够抑制A.ferrooxidans BYM生长。在摇瓶试验中，通过添加30 mmol/L TritonX-100在A.ferrooxidans XZ11浸取黄铜矿的体系中，培养24 d，结果表明铜的生物浸出率相较于未添加有机物组提升了42.21%[38]。0.04 mmol/L EDTA处理A.ferrooxidans 1 h后，能够去除表面脂多糖，对细胞形态和活性均未产生影响[39]。
结果表明(图4)，有机酸中l-抗坏血酸和苹果酸对A.ferrooxidans BYM生长具有促进作用。抗坏血酸作为微量元素可以参与生物体的代谢过程，作为小分子抗氧化剂可以中和细胞代谢产生的活性氧和自由基对机体造成的损伤[40]。抗坏血酸作为辅酶因子为羟化酶和单加氧酶等15种哺乳动物内酶提供电子，参与了肉碱、胶原蛋白和神经递质合成等过程[41]。因此，可推测试验中添加l-抗坏血酸能够通过还原作用消耗A.ferrooxidansBYM代谢产生的Fe3+。柠檬酸的添加不能促进A.ferrooxidans BYM生长。苹果酸作为三羧酸循环中的一环，其在某种程度上促进了菌体的代谢，从而对亚铁氧化产生了促进作用。本研究通过添加0−30 mmol/L苹果酸，明确了5 mmol/L的苹果酸能够促进A.ferrooxidans BYM生长。葡萄糖酸能够螯合培养基中的铁离子，从而促进A.ferrooxidans BYM的亚铁氧化速率。吐温-80、TritonX-100以及SDS对A.ferrooxidans BYM亚铁氧化均起到了抑制作用，这可能是由于以上3种表面活性剂改变了A.ferrooxidans BYM细胞表面张力，抑制了A.ferrooxidans BYM生长，从而导致亚铁氧化速率降低。本研究选择EDTA-2Na的原因是其相较于EDTA在酸性条件下更容易溶解，因此选择EDTA-2Na作为外源有机物进行试验。结果分析表明，EDTA-2Na不能促进A.ferrooxidans BYM亚铁氧化，并且随着EDTA-2Na浓度升高，可能会螯合培养基中的铁离子，抑制A.ferrooxidansBYM生长。
向M.magneticum AMB-1培养体系中添加EDTA、罗丹明B、抗坏血酸、赤藓红、邻氨基苯甲酸、柠檬酸、3-(N-吗啉)丙磺酸、3-(环己胺)-1-丙磺酸、钙黄素、葡聚糖、阿仑膦酸、奈立膦酸和烟酰胺等铁螯合剂可以促进菌株生长并提高磁小体产量；我们前期的研究也发现，葡萄糖酸可以有效促进A.ferrooxidans的生长并促进菌体合成磁小体[42]。一些有机物可以使细菌的表面变得更为光滑，并使菌体表面的官能团变化[43]。这与本研究SEM及FTIR获得的经葡萄糖酸处理后A.ferrooxidans BYM表面变得光滑(图6A、6B)、表面官能团发生变化的结果一致(图7)。对于趋磁的磁小体合成细菌M.magneticum AMB-1而言，有机物可以通过增加磁小体链的长度来提高其单个细胞的磁小体数量[42]，尽管非趋磁性的A.ferrooxidans BYM不存在磁小体链，但葡萄糖酸作用后菌体内的磁小体数量仍然增加，原因可能是葡萄糖酸促进了菌体对铁的吸收，具体机制仍需要进一步研究。
微生物发酵动力学能够探究A.ferrooxidans BYM在整个发酵过程中的菌体变化、磁小体生成和亚铁消耗情况，此过程为磁小体的规模化发酵提供理论和实践依据。发酵动力学作为描述发酵过程微生物生长、产物生成和底物消耗的学科，能够在发酵过程中通过模型建立实现发酵的动态监控，以达到高效生产。目前，发酵动力学主要分为菌体生长动力学、产物生成动力学和底物消耗动力学。Logistic方程作为经典菌体生长动力学模型，广泛用于微生物的发酵研究，Logistic方程描述了三孢布拉霉发酵生产番茄红素过程中菌体生长情况，并很好地描述了菌体生长的动态情况[44]。Logistic方程对于嗜酸乳杆菌的菌体发酵进行描述，并对其在48 h内菌体生长进行分析[21]。对拉曼HLY0902进行摇瓶发酵动力学研究，利用Logistic方程建立了菌体生长动力学模型[20]。产物生成动力学是描述产物生成与菌体生长之间的关系的科学，通过对产物生成动力学的探究，可以明确单一发酵和复合发酵的不同机制。底物消耗动力学一般与细胞生长、产物生成和维持底物消耗的能量3种因素相关。通过描述发酵动力学，能够对菌体生长、目标产物生成、底物消耗过程等阶段进行明确调控，这对于分批发酵和连续发酵生产具有关键性意义。
本文以A.ferrooxidans BYM为目的菌株，探究在10 mmol/L葡萄糖酸下4 L发酵体系代谢变化。通过分批培养测定A.ferrooxidans BYM的生物量、磁小体生成量和亚铁氧化速率，明确A.ferrooxidans BYM在各个阶段的变化情况。基于经典Logistic方程、Luedeking-Priet方程以及发酵动力学模型成功构建了A.ferrooxidans BYM菌体生长、磁小体合成及亚铁消耗动力学模型，其拟合度R2分别为0.99、0.98及0.98，数值均大于0.90，说明模型能够很好地反映A.ferrooxidans BYM发酵动力学。通过非线性拟合的方法拟合得到的3个方程与实际值接近，误差较小，能够很好地反映A.ferrooxidans BYM在各个阶段发酵变化。3个发酵模型的建立为今后的发酵条件控制和磁小体规模化发酵提供了一定的理论参考价值。
4、结论
本研究以A.ferrooxidans BYM为研究对象，通过单因素试验探究10种外源添加有机物对其生长的影响，根据试验结果筛选得到对磁小体合成促进效果最明显的一种有机物。在最优促进剂下对A.ferrooxidans BYM在发酵过程中的菌体生长、磁小体合成以及亚铁消耗动力学进行研究。通过以上探究过程，本研究得出以下结论：
(1)通过亚铁氧化速率的测定，筛选出l-抗坏血酸、苹果酸以及葡萄糖酸对A.ferrooxidans BYM生长具有显著的促进作用，并确定了合适的浓度范围。
(2)通过4 L体系发酵试验，对3种有机物进行浓度优化。获得最优促进剂葡萄糖酸，以10 mmol/L添加时，磁小体产量可达2.00×10−3 g/L。
(3)通过不同时间梯度的分批发酵试验，本研究建立了A.ferrooxidans BYM的菌体生长、磁小体生成和亚铁消耗动力学模型。
研究结果表明在葡萄糖酸的作用下能够对A.ferrooxidans BYM发酵过程进行调控，改善磁小体发酵过程，为后续大体系通过微生物发酵产磁小体提供理论及实践依据。
10种有机物对氧化亚铁硫杆菌BYM磁小体生长、合成、发酵、产量的影响（一）
10种有机物对氧化亚铁硫杆菌BYM磁小体生长、合成、发酵、产量的影响（二）
10种有机物对氧化亚铁硫杆菌BYM磁小体生长、合成、发酵、产量的影响（三）