红曲霉发酵方法、生长曲线及工艺优化
红曲霉在发酵过程中产生莫纳可林（Monacolin K），莫纳可林能够降低胆固醇，具有非常好的药用价值。目前红曲霉发酵生产莫纳可林存在产量偏低、生产成本偏高等问题。碳源是构成菌体和产物的碳架及能量来源，不同的碳源会通过影响菌体形态进而影响所需产物的产量。氮源是构成菌体细胞中核酸、蛋白质和细胞质的主要成分，是菌体的生长发育和发酵代谢物的合成积累必不可少的物质基础。发酵基质对于红曲霉来说，是其生长、代谢、繁殖的物质基础，因此发酵培养基的组成成分会对红曲霉的生长状况和莫纳可林的生成产生很大的影响。因红曲霉个体小、代谢旺盛等特点，对生长环境的要求也相对较严格，外界环境的变化很容易影响到红曲霉的代谢途径，使其产物发生明显的改变，所以通过控制红曲霉发酵时的发酵条件来增加莫纳可林的产量已经成为一种现代微生物发酵技术常用的技术手段。公开号为CN107475301A的中国专利申请公开了一种高产红曲色素和Monacolin K的功能红曲的制备方法，所述方法通过在发酵过程中加入不同的金属离子以及控制发酵温度提高红曲色素和莫纳可林的产量。上述方法没有从根本上去解决发酵培养基的成分影响红曲霉的发酵生产莫纳可林产量的问题。另外，影响红曲霉发酵的外界环境因素有很多，不只是温度的影响。因此有必要提出一种红曲霉的发酵工艺优化方法。
红曲霉的发酵工艺优化步骤：
步骤1：根据种子培养液制备基础培养基，在基础培养基中分别加入不同种类的碳源后发酵红曲霉，测量基础培养基中目标产物的产量，生成第一产量柱形图，确定发酵培养基的目标碳源。种子培养液的pH为6.0，种子培养液包括：1克/升的酵母膏、1克/升的K2HPO4、0.01克/升的MgSO4·7H2O、0.01克/升的FeSO4·7H2O。在本实施例中，在多个250毫升的三角瓶中分别装入80毫升种子培养液制备基础培养基，将三角瓶在121℃灭菌30分钟，分别加入不同种类的碳源，接种等量的红曲霉，在28℃下，150r/min摇床发酵12天后，测量基础培养基中目标产物的产量生成第一产量柱形图。碳源指的是能够为红曲霉提供碳元素以支持其生长和代谢的有机化合物。碳源的种类包括葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉、甘油、乳糖，选择该6种碳源进行实验获取数据。目标碳源为甘油。
目标产物为莫纳可林，测量基础培养基中目标产物的产量的步骤：将发酵结束后的基础培养基于50℃下烘干、粉碎得到发酵粉，加蒸馏水将发酵粉恢复至基础培养基烘干前的体积得到发酵液，调整发酵液的pH为6.3，量取10毫升的发酵液，加入40毫升的甲醇，超声反应20分钟，50℃水浴2小时，间歇振荡3-4次，3000r/min离心3分钟，经0.45μm的滤膜过滤得到上清液，将上清液置于冰盒上通过高效液相色谱仪进行检测。除此之外，还可以通过双波长法测量基础培养基中目标产物的含量，红曲霉除了代谢生产莫纳可林还会生产红曲色素，红曲色素会影响莫纳可林的测量，利用红曲色素在246纳米和254纳米波长处吸光值基本相同，而莫纳可林在该两处的吸光值存在明显差异的特性，通过分光光度法测量基础培养基在246纳米和254纳米处吸光值之差，从而有效的排除红曲色素对测量的影响，达到准确测量的目的。
步骤2：在基础培养基中分别加入不同浓度的目标碳源后发酵红曲霉，测量基础培养基中目标产物的产量，生成第一产量曲线，确定目标碳源的第一目标浓度。最高目标产物的产量所对应的目标碳源的浓度为第一目标浓度。本实施例的第一目标浓度为65毫升/升，即每升基础培养基包含65毫升的目标碳源。
步骤3：在基础培养基中分别加入不同种类的氮源后发酵红曲霉，测量基础培养基中目标产物的产量，生成第二产量柱形图，确定发酵培养基的目标氮源。氮源是指能够为红曲霉提供氮元素的营养物质，是构成红曲霉蛋白质、核酸和其他重要含氮化合物的关键成分。氮源的种类包括蛋白胨、谷氨酸钠、酵母粉、黄豆粉。选择该4种氮源进行实验获取数据。除氮源外，在基础培养基中还要加入等量的目标碳源，在28℃下发酵12天。最高目标产物的产量所对应的氮源为目标氮源。
步骤4：在基础培养基中分别加入不同浓度的目标氮源后发酵红曲霉，测量基础培养基中目标产物的产量，生成第二产量曲线，确定目标氮源的第二目标浓度。最高目标产物的产量所对应的目标氮源的浓度为第二目标浓度。
步骤5：确定影响红曲霉发酵的至少两个基础因子并生成因子集合，根据第一目标浓度的目标碳源和第二目标浓度的目标氮源制备发酵培养基。因子集合包括初始pH、温度、接种量、溶氧量、培养时间。制备发酵培养基的步骤：在250毫升的三角瓶中装入80毫升的种子培养液，然后将三角瓶在121℃灭菌30分钟，最后加入第一目标浓度的目标碳源和第二目标浓度的目标氮源。
步骤6：在发酵培养基中发酵红曲霉，根据单因素实验得出基础因子的高水平值和低水平值，从因子集合中筛选核心因子并生成核心因子集合，确定核心因子集合的组合高水平值。单因素实验是一种控制因子集合中的一个基础因子为变量，其余基础因子保持基准值的实验。在本实施例中，因子集合中的各因子的基准值为6.0、30℃、5%、80%、12天，初始pH的实验范围为[3.0，6.0]、温度的实验范围为[25℃，37℃]、接种量的实验范围为[5%，15%]、溶氧量的实验范围为[65%，100%]、培养时间的实验范围为[0天，16天]。最高目标产物的产量对应的因子变量的值为高水平值，低水平值为小于高水平值的因子变量的值。低水平值有多个，根据实验需求和因子变量的实验范围选择高水平值附近的一个低水平值。遍历的选择因子集合中的一个因子作为因子变量，其余因子保持基准值，设计单因素实验。
本实施例的初始pH的高水平值为5.0，低水平值为4.0；温度的高水平值为28℃，低水平值为25℃；接种量的高水平值为10%，低水平值为5%；溶氧量的高水平值为96%，低水平值为65%；培养时间的高水平值为16天，低水平值为10天。通过设计普拉克特-伯曼实验，从因子集合中筛选核心因子并生成核心因子集合，进行普拉克特-伯曼实验设计时，另设至少一个空项进行误差分析，以目标产物的产量为响应值，具体步骤在实施例二中进行说明。通过最陡爬坡实验，确定核心因子集合的组合高水平值，本实施例的组合高水平值为5%的接种量、95%的溶氧量、14天的培养时间。最陡爬坡实验是实验设计中的一种方法，主要用于探索响应值最大所在的区域，这种方法是在普拉克特-伯曼实验设计之后使用，以识别出对响应值有显著影响的因素，即核心因子集合，并确定核心因子集合的组合高水平值。
步骤7：控制多组发酵培养基保持核心因子的组合高水平值，发酵培养基进行不同时间的发酵红曲霉，生成红曲霉生长曲线、目标产物产量曲线、底物消耗曲线。发酵红曲霉时，保持核心因子之外的基础因子处于高水平值。通过高效液相色谱仪测量目标产物的产量，通过生物传感仪测量剩余底物的含量。
红曲霉生长曲线
步骤8：拟合红曲霉生长曲线、目标产物产量曲线、底物消耗曲线，得出红曲霉生长函数、目标产物产量函数、底物消耗函数。逻辑斯蒂方程是典型的S型曲线，在描述红曲霉菌体生长方面被广泛应用，效果较好，因此可以选用逻辑斯蒂方程对红曲霉生长曲线进行拟合得出红曲霉生长函数。选用吕德金-皮雷特方程来描述红曲霉发酵的目标产物的生成规律，对目标产物产量曲线进行拟合得出目标产物产量函数。采用吕德金-皮雷特型方程对底物消耗的过程进行描述，对底物消耗曲线进行拟合的得出底物消耗函数。红曲霉生长函数
步骤9：根据红曲霉生长函数得出第一时间，根据目标产物产量函数得出第二时间，根据第一时间、第二时间和底物消耗函数确定发酵培养基的底物添加函数。底物添加函数a(t)=s(t)-s(t+Δt)，a为底物添加量，Δt为底物添加周期，Δt=1，t1＆lt;t＆lt;t2，t1为第一时间，t2为第二时间，第一时间为红曲霉生长函数的生物量达到最大值时的最小发酵天数，第二时间为目标产物产量函数的目标产物的产量达到最大值时的最小发酵天数。第一时间为6天，第二时间为15天。
步骤10：根据目标碳源、第一目标浓度、目标氮源、第二目标浓度、核心因子的组合高水平值和底物添加函数输出红曲霉的发酵参数。本实施例的发酵参数包括甘油浓度65毫升/升、黄豆粉3克/升、5%的接种量、95%的溶氧量、14天的培养时间、底物添加函数a(t)。通过红曲霉的发酵参数从发酵培养基的组成成分、外界影响因素和底物添加三个方面优化红曲霉的发酵工艺。
有益效果：本发明通过基础培养基对红曲霉进行发酵实验寻找合适的目标碳源和目标氮源，以及目标碳源的第一目标浓度和目标氮源的第二目标浓度。通过发酵培养基发酵红曲霉，筛选出核心因子集合，根据核心因子集合、核心因子的高水平值设计最陡爬坡实验确定核心因子集合的组合高水平值。通过控制发酵培养基的核心因子保持组合高水平值，对红曲霉进行不同时间的发酵，生成红曲霉生长曲线、目标产物产量曲线、底物消耗曲线。对所述曲线进行拟合得出红曲霉生长函数、目标产物产量函数和底物消耗函数。根据红曲霉生长函数、目标产物产量函数和底物消耗函数确定发酵培养基每天的底物添加函数，保证发酵培养基中的红曲霉能有足够的营养物质进行发酵、生产目标产物，同时避免营养物质过多而使红曲霉进一步繁殖影响目标产物的生产。