生长延滞期是什么意思？微生物生长延滞期检测方法
食源性疾病是全球最重要的公共卫生问题之一，引发食源性疾病的物质包括病原微生物、寄生虫、天然毒素以及化学性有毒有害物质等，其中由食源性致病菌引起的食源性疾病是全球食品安全面临的最重要挑战之一。近20年来，国内对食源性致病菌的关注度持续上升，关于中国食品中食源性致病菌的检出情况也有较多报道。2000—2014年，我国暴发的食源性疾病中一半以上是因为食用致病菌污染的食品而引起的。相较于物理及化学污染物，食源性致病菌引发的食品安全事件暴发率更高。针对此类食品安全问题，在食品工业中应采取更有效的措施来控制食品中致病菌的污染水平，并估算其在不同食品加工及流通条件下的生长参数，以降低因食源性致病菌引发的食源性疾病暴发风险。
在食源性致病菌的生长预测研究中，生长延滞期与最大比生长速率是两个重要的生长参数。相较于最大比生长速率，生长延滞期更难定义和准确预测，且微生物群体与单细胞水平下的生长延滞期概念与测定方法也并不相同。因此，为更加准确地预测生长延滞期，研究影响其变化的相关因素至关重要。此外，通过基于实验的观测结果结合预测微生物学模型来计算生长延滞期的方法已被广泛研究，而对生长延滞期中胞内相关生理生化指标的变化及其对食源性致病菌生长的影响研究鲜少，研究相关生理生化指标的变化有利于从机理出发进一步准确地描述生长延滞期，并且有助于评估模型预测结果的准确性，因此值得深入探讨。
目前，如何准确预测食源性致病菌生长延滞期已成为食品安全风险评估相关研究的热点和难点之一。本文首先对生长延滞期的检测方法进行归整和分析，并重点介绍生长延滞期的影响因素及可作为生长延滞期生理标记的相关胞内活动，最后对生长延滞期研究的发展趋势提出建议，以期对食源性致病菌的相关风险管理控制提供一定的理论支持。
1、生长延滞期
生长延滞期在生物学上被普遍接受的定义为：微生物群体适应新环境的时间。延滞期之后细胞群体将开始分裂繁殖；而在微生物典型的S型生长曲线中，生长延滞期的几何定义为：微生物对数生长期达到最大比生长速率时，生长曲线切线的反向延长线和初始菌量水平延长线的交点在时间轴上的投影点与零时刻的时间间隔。这也是目前预测微生物学建模中计算生长延滞期最常用的方法。微生物单细胞生长延滞期指的是单个细胞到达第一次分裂所需的时间，该时间段包括损伤修复及合成某种必需分子激发分裂的时间。无论是食源性致病菌的群体还是单细胞，对其生长延滞期的控制均有利于降低食品安全风险，数学模型预测致病菌生长的准确性很大程度上也取决于该模型对延滞期的预测能力，因此更好地理解生长延滞期并将其涉及的生理学知识纳入预测微生物学模型中，对该模型在食品安全与质量管理中的有效应用具有重要意义。由于目前关于生长延滞期过程中涉及的相关生理过程（如蛋白质组学、代谢组学等角度）并未完全了解，并且微生物的本质属性及环境作用共同决定了细胞个体的生理状态，因此需从机理角度出发进一步准确地定义生长延滞期。
2生长延滞期的检测方法
目前微生物生长延滞期是通过建立生长曲线并结合预测微生物学模型计算获得，而生长曲线的获取需要足够多且有效的数据点，因此生长延滞期的测定方法依赖于微生物细胞的定量方法。传统的平板计数法是获取微生物群体生长数据的最主要手段，而此法耗时较长，会导致数据无法实时获取。相比之下，比浊法因其操作简便、省时省力的优点被较多应用于微生物生长曲线的测定和建模研究中。然而由于比浊法具有检测限高（106～107CFU/mL）、适用范围窄（只可用于液体基质的测定）等不足而导致获得的生长延滞期存在一定偏差。随着微生物定量技术的发展，实时荧光定量聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）、数字PCR、变性梯度凝胶电泳、流式细胞术及生物传感器等技术被应用于预测微生物学的研究中，这些技术具有快速、高效等优点，改善了传统方法的不足，具有良好的发展前景。表1总结了可应用于测定食源性致病菌生长延滞期的相关技术。
表1可应用于测定食源性致病菌生长延滞期的微生物定量方法
单细胞生长延滞期的测定不同于群体细胞，单细胞生长具有较大变异性，因此需获取大量的实验数据以体现其真实性。获取单细胞生长延滞期最直接的方法是通过显微镜观察单细胞的分裂过程，显微观测法从1932年Kelly等在显微镜下观察到微生物单细胞分裂过程后得到快速的发展。然而，由于观测视野中多个细胞连续分裂导致子代细胞很快布满视野，因此大多数基于此方法的研究也只能观测到细胞分裂2次或3次，不利于对单细胞进行长时间的连续观测。为解决这一缺陷，Elfwing等设计配有生长流动槽装置的显微观测系统，此方法可通过提高流动液体流速将分裂产生的子细胞冲走，使得目标细胞的生长繁殖不会受到子代细胞生长的影响，同时采用低倍暗视野显微镜拍摄，能够在同一批次的实验中获得大量单细胞的生长数据，实现了对微生物单细胞生长的连续监测，且通过改变流动液体环境还能够研究不同条件下单细胞的生长规律。基于以上优点，流动槽装置已在许多单细胞的研究中得到应用。随着显微观测与计算机技术的发展，通过结合荧光来观测单细胞生长已成为显微观测的发展趋势之一，如激光扫描显微镜已被应用于观测荧光介导的单细胞生长分析中。此外，采用流式细胞仪结合不同的荧光染料也能获取单细胞的生理指标参数，如细胞膜完整性（可用荧光强度表征）、膜表面电位及胞内pH值等，然而此方法不能连续地监测单细胞的生长分裂过程。近年来，为长时间有效地监测微生物单细胞在特定环境中的生长行为，单细胞的实验芯片技术成为众多研究的焦点，如在此基础上研发的能够观测单细胞生长的微流体装置。除直接观测单细胞的生长分裂外，检测时间法是间接推算单细胞生长延滞期的最常用方法，即通过全自动微生物生长曲线分析仪测定由初始吸光度增加至菌液浓度为106～107CFU/mL时对应吸光度所需要的检测时间。表2总结了应用不同方法测定单细胞生长延滞期的相关研究。
表2应用不同方法测定单细胞生长延滞期的相关研究
综上所述，在食源性致病菌生长延滞期的测定中，群体水平上以传统平板计数法为基础的测定方法具有选择性，且在实际操作中费时费力。新型的微生物定量方法具有较好的应用前景，但每种方法都有自己的优势和弊端，食品基质、致病菌的数量也均会影响检测结果的准确性，因此需持续开发微生物定量新技术，以满足检测结果更准确、成本更低、检测时间更短的要求。单细胞观测方法上的创新是更加准确地获取大量且有效的生长数据的前提。在未来的研究中应多关注于群体细胞生长延滞期及单细胞分裂所涉及的机理，并基于此而更加明确生长延滞期的定义，从而建立更快速、更准确的测定方法。
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