耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的群体感应系统-附属基因调节（agr）系统，调控多种毒力因子表达，其中最重要的一类毒力因子是葡萄球菌溶素。MRSA 还能够表达一些黏附蛋白，促进细菌生物膜的形成。这些毒力因子在MRSA 侵袭性感染过程中发挥重要作用。RNAⅢ抑制肽（RIP）是agr 系统抑制剂。本研究设计合成了新的RIP 衍生物RIP1183，检测其对MRSA 的生长和生物膜形成的影响，以及在不同时相对重要毒力因子表达的影响，探讨RIP1183 抗菌、抗生物膜的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂

微量RNA 提取试剂盒RNeasy Mini Kit（QIAGEN），细菌RNA 提取试剂盒RNAprep pure Bacteria Kit，反转录试剂盒PrimeScript Kit，Premix Taq RT-PCR 系统（TaKaRa）。异硫氰酸荧光素（FITC）、葡萄糖均购自Sigma 公司；胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养基购自北京陆桥技术有限责任公司。

1.2 菌株和药品

MRSA（USA300）由美国国立卫生研究院（NIH）的Michael Otto 教授友情惠赠。RIP1183 由本课题组设计，委托空军军医大学生物制药教研室合成，白色疏松粉末，批号：20141001，含量：99.41%，保存条件：-20℃低温保存。

1.3 细菌培养

按照1∶100 的比例接种MRSA（USA300）至5 mL的培养基中，37℃振荡培养14 h，将过夜培养的细菌分别转接至10 mL TSB 培养基 （含0.5%的葡萄糖），将细菌浓度调整至1×108CFU/mL。RIP 组加入RIP1183使其终浓度为50 μg/mL。对照组加入无菌磷酸盐缓冲液。37℃振荡培养，每隔2 h 测定1 次吸光度（OD）630值，监测12 h 内细菌生长情况，实验重复3 次。

收集菌体，细菌培养操作同上，每隔2 h 吸取100 μL 菌液，12 000 r/min，4℃，离心10 min，弃去上清，收集沉淀（细菌），保存至-80℃冰箱中。

1.4 细菌生物膜

细菌过夜培养，用含有0.5%葡萄糖的TSB 培养液将菌液稀释至1×106CFU/mL，接种于48 孔培养板中。RIP 组加入RIP1183，使药物终浓度为50 μg/mL，对照组加入无菌磷酸盐缓冲液。37℃湿盒中孵育48 h后，弃上清，无菌磷酸盐洗掉浮游菌和杂质。然后用FITC（0.1 mg/mL）标记贴壁细菌，无菌磷酸盐清洗3 次，避光4℃保存，荧光显微镜（Olympus，CKX41）观察贴壁细菌并拍照。使用Image J 软件定量分析荧光强度。

1.5 qRT-PCR

为了探讨金黄色葡萄球菌不同生长时相，agr 系统的激活情况，以及RIP1183 对细菌葡萄球菌溶素和生物膜形成的影响，分别检测细菌迟缓期（2 h）、对数期（6 h）和稳定期（10 h）16S rRNA、RNAⅢ、人类白细胞抗原（HLA）、icaA 和fnbA 基因的表达水平。

收集的细菌，按照微量RNA 提取试剂盒RNeasy Mini Kit 说明书，提取细菌总RNA。将RNA 溶于30 μL的DEPC 水，然后用反转录试剂盒PrimeScript RT reagent Kit 获得cDNA。qRT-PCR 反应：反应体系20 μL，包括cDNA 2 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ10 μL，上游引物（10 μm）1 μL，下游引物（10 μm）1 μL，无菌ddH2O 6 μL。反应条件：segment 1：95℃、5 min；segment 2：95℃、10 s，55℃、30 s，40 个循环；segment 3：95℃、15 s，55℃、60 s，95℃、15 s；每个反应重复3 次。用2-ΔΔCT法计算分析各组基因相对于内参基因16S rRNA的表达量。用于检测基因表达水平的引物序列，见表1。

表1 用于检测基因表达水平的引物序列

1.6 统计学方法

采用GraphPad Prism Version 5.0 统计软件对所得数据进行统计学分析，计量资料用均数±标准差（）表示，采用独立样本t 检验。以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RIP1183 对MRSA（USA300）生长曲线的影响

MRSA（USA300）培养在含葡萄糖的TSB 培养基中，2 h 后由迟缓期进入对数期，8 h 后进入稳定期；RIP 组加入RIP1183（50 μg/mL），MRSA（USA300）同样是在2 h 进入对数期，8 h 后进入稳定期。与对照组比较，RIP1183 不影响细菌生长，差异无统计学意义（P ＞0.05）。见图1。

图1 RIP1183 对MRSA（USA300）生长曲线的影响

2.2 RIP1183 对细菌生物膜形成的影响

与对照组比较，RIP 组细菌生物膜形成显著减少（P ＜0.01）。见图2。

RIP 衍生物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线及生物膜形成的影响（一）

RIP 衍生物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线及生物膜形成的影响（二）

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