朱鹮细胞系的建立、体外生长特征、性染色体的荧光原位杂交鉴定（一）
朱鹮(Nipponia nippon)属鹳形目(Ciconiiformes)鹮科(Threskiornithidae)朱鹮属(Nipponia),是世界级珍稀濒危物种,国家I级重点保护鸟类。朱鹮曾经广泛分布于日本、朝鲜半岛、中国和俄罗斯西伯利亚西南部。然而,20世纪中叶以来,由于环境污染、全球气候变暖、捕猎和人类活动等因素的影响,朱鹮的数量急剧减少,野生种群在日本、朝鲜半岛和俄罗斯的分布地区先后消失。中国自从1964年在甘肃康县采集到一只标本后,直到1981年的近20年一直没有朱鹮的报道（Ding,2004)。1981年野生朱鹮种群(7只)在陕西洋县被重新发现（Liu,1981)。此后,我国在朱鹮的保护和研究方面开展了大量的工作,主要包括朱鹮生态生物学、保护生物学、遗传学、解剖学、饲养繁殖、病理学、疾病防治以及保护管理和再引入等。由于国家的高度重视,野生朱鹮及其栖息地得到了有效保护,野生种群数量不断增加。同时,朱鹮人工饲养繁殖也与野生种群的保护同步进行。1989年,北京动物园人工繁殖朱鹮在世界上首次获得成功(Li,1989)。随后三个朱鹮人工种群分别在北京和陕西建立,有力保证了朱鹮种群的恢复和发展。大量的研究工作也为朱鹮的科学保护奠定了坚实的基础（Ding,2004)。
野生动物的遗传资源保护,除建立专门的保护机构、制定相关法律和建立国家公园、自然保护区及易地保护外,以深低温(-196°C)冻存动物的生殖细胞和体细胞则为另一条有效的途径(Shi,1989)。细胞是生命的基本单位,具有生命所有的遗传信息。动物体细胞系的建立,为从细胞和分子水平开展各类研究提供经济、方便的材料来源,也为以后再建当时或许已灭绝的物种提供材料储备。迄今为止,还没有关于朱鹮体细胞成功建系的报道。对我国的朱鹮,Liu et al（1992)报道了两只饲养于北京动物园的朱鹮的染色体性别鉴定及核型分析的结果,但未见朱鹮染色体G带、C带和Ag带的报道。
本研究利用微创取样方法,在不对朱鹮造成致命伤害的前提下,获得其皮肤样本,成功建立了朱鹮的体细胞系,并对该细胞系的体外生长特征、性染色体的荧光原位杂交鉴定以及染色体G带、C带和Ag带等进行了分析。
1材料和方法
1.1材料来源
雌、雄两只成年朱鹮均来自陕西朱鹮人工繁殖中心。取材前彻底消毒背部皮肤,用眼科剪剪下～0.5 cm×1 cm的一块皮肤,迅速放入运输培养基内。动物行伤口缝合处理后放回饲养网。
1.2细胞培养
细胞培养用运输液为含有100 U/mL青霉素钠以及100μg/mL链霉素的DMEM(GIBCO);生长液为含有10%胎牛血清的OPTI-MEM(GIBCO),pH 7.2～7.4;培养器皿为培养面积25 cm2的一次性塑料培养瓶(Corning)。
1.2.1原代细胞培养
使用含两倍双抗的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)洗涤皮肤组织块5次,剪小至～1 mm;加入0.25%胰酶(1:250,Amresco)0.5 mL消化0.5 min后迅速加入生长液抑制胰酶作用;PBS清洗一次后,将组织块贴至培养瓶瓶壁,1 h后加入1 mL生长液,37°C培养24 h后补加培养液至5 mL;此后每3天换液一次。待15 d后可见细胞开始从组织块长出,再培养5 d后即可传代。
1.2.2细胞传代
待组织块周围细胞均长成致密的单层后即可进行细胞传代。弃去生长液,PBS清洗一次后加入0.25%胰蛋白酶1 mL,37°C消化1～2 min后加入5 mL新鲜生长液;轻拍瓶壁分散细胞,补加生长液至15 mL后吸出一半至另外一个培养瓶(1:2传代);37°C,5%CO2条件下培养,待长成单层后,再按上述方法传代。
1.2.3细胞冻存
用0.25%胰酶消化、收集对数生长期细胞,离心后弃去上清液;加入新鲜配制的冻存液[小牛血清90%,二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO,Amresco)10%]制备成2×106个/mL的细胞悬液,每个冻存管分装1 mL;冻存管置于程序冻存盒(Nalgen)内,-80°C过夜后,移入液氮内长期保存。
1.2.4细胞复苏
从液氮中取出冻存管后迅速放入37°C水浴中,让细胞在1～2 min内完全融化;在无菌环境下将细胞接种到培养瓶内,37°C,5%CO2条件下培养。3 d后细胞即可长成单层。
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