广西牛肺炎支原体病原的分离和鉴定、药敏实验分析（上）
近几年来广西从外省引进肉牛饲养的现象很普遍，因运输应激因素诱发呼吸系统症状的疾病经常发生，临床表现为发热、流涕、咳嗽和呼吸困难，最终导致死亡。给养殖户造成很大的经济损失。为了弄清病因，2013年8月我们对桂林市某牛场出现的类似病例进行了病原调查。该场原有存栏牛336头，2013年7月11日从北方某省引进肉犊牛93头，到场后隔离观察，第3天发现有牛出现喘气，体温升高。随后多数牛也开始发病并出现严重的呼吸困难，卧地不起，拉稀或血样粪便，部分牛最后因衰竭而死。曾用头孢类抗生素治疗无效，整个病程27头牛发病，死亡7头，发病率和病死率分别为29%（27/93）和25.9%（7/27）。剖检病死牛，病变局限在胸腔与肺部，肺尖叶、心叶和膈叶都表现出不同程度的红色肉变，肺间质增宽，还可见大小不等的黄白色坏死灶，气管、支气管里有大量的乳白色泡沫。胸腔有少量积液，心包积水，液体呈清亮黄色。其他脏器未见肉眼可见病理变化。经对病原分离培养、形态学观察、生化试验和病原特异性基因PCR检测，鉴定该病病原为牛支原体。
1材料与方法
1.1试验材料
病死牛肝、肾、肺、淋巴结。
1.2试剂和仪器
PPLO肉汤粉，购自杭州百思生物技术有限公司；琼脂、TSA琼脂、酵母，购自北京陆桥生物技术有限责任公司；马血清，购自广东蕊特生物科技有限公司；青霉素，购自山东鲁抗医药股份有限公司；微生物生长动态监测系统oCelloScope，购自丹麦Biosense；微量DNA提取试剂盒，购自天根生化科技（北京）有限公司，DNA Marker2、PCR Taq Mix，购自广东东盛生物科技有限公司；PCR仪，购自日本TaKaRa公司；凝胶成像系统，购自美国Alpha Inotech公司。
1.3方法
1.3.1病原分离、形态观察、细菌L型实验和生化性状测定等均按石磊的方法进行。
1.3.2病原PCR鉴定
按李大伟的方法进行病原的牛支原体特异性基因opp D/F的PCR鉴定，同时应用牛传染性胸膜肺炎特异性引物对样品进行鉴别诊断。将PCR扩增产物连接到pMD-18T载体中，对获得的克隆进行鉴定后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序和分析。
1.3.3药敏试验
oCelloScope可量化添加抗菌药物后牛肺炎支原体的生长动力学，快速确定支原体的生长情况和对抗生素的耐药性。
1.3.4其他细菌的分离
无菌取病牛肝、肾、肺、淋巴结分别接种TSA琼脂培养基和兔血营养琼脂培养基，37℃培养48 h观察结果。
2结果
2.1病原的分离培养和菌落形态
初次培养时，将肺组织匀浆后的上清液接种PPLO培养液后3 d，培养基颜色开始变为棕黄色，继续传代培养时，培养基颜色变色时间缩短，在1——2 d，便可由红色变为棕黄，培养液颜色均一，透亮无混浊现象。固体培养基上，2——4 d便可见针尖大小的菌落生长，在4X10倍视野下观察所有平皿均有典型的“煎蛋样”菌落出现，核心较厚，向下长入培养基中，周边为一薄层的透明区（图1）。
图1病原菌落观察（4X10）
图2病原姬姆萨染色观察（10X100）
2.2病原的染色形态观察结果
分离的病原革兰染色不易着色，难以观察；姬姆萨染色呈紫蓝色，菌体呈现明显的多形态，多数呈球形，也有少数长短不一的杆状或蝌蚪状的菌体散在分布（图2）。
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