RIP 衍生物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线及生物膜形成的影响（二）
2.3 不同时相RIP1183 对RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA基因表达水平的影响
迟缓期（2 h），两组RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 总体表达水平都较低；对数期（6 h），RNAⅢ和HLA 表达水平快速升高；稳定期（10 h），RNAⅢ和HLA 表达水平下降，但是生物膜形成的黏附相关基因（icaA 和fnbA）的表达水平升高。
迟缓期（2 h），与对照组比较，RIP 组RNAⅢ表达明显降低（P ＜0.05）。对数期（6 h），与对照组比较，RIP 组RNAⅢ、HLA 表达显著降低（P ＜0.01）；稳定期（10 h），与对照组比较，RIP 组icaA、fnbA 和RNAⅢ表达显著降低（P ＜0.05 或P ＜0.01）。见表2。
图2 RIP1183 对细菌生物膜形成的影响
表2 不同时相RIP1183 对RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因表达水平的影响（，n=6）
注：与对照组同期比较，*P ＜0.05，**P ＜0.01；HLA：人类白细胞抗原；RIP：RNAⅢ抑制肽
3 讨论
agr 群体感应系统是金黄色葡萄球菌的重要调控系统，参与调节细菌多种生理活动，对于维持金黄色葡萄球菌生物膜结构和细菌的致病性也是必不可少的[9-10]。RNAⅢ是agr 系统的效应分子，agr 系统激活后，RNAⅢ表达水平升高，RNAⅢ通过与靶基因5’非翻译区（5’UTR）反义碱基配对，形成RNA 双链体，从而进一步调控一系列靶基因的表达。RNAⅢ调控多种毒力因子表达包括葡萄球菌溶素和细菌生物膜形成相关蛋白的表达。
其中最重要的1 种葡萄球菌溶素是α-溶血素，由HLA 基因编码，它可以破坏宿主多种细胞的细胞膜，改变细胞渗透压，使宿主细胞溶解。动物实验表明，敲除金黄色葡萄球菌HLA基因后，显著降低了其对感染动物的致病性。纤连蛋白结合蛋白FnbA 是由fnbA 基因编码的1 种多阈结构的蛋白质，它能够吸引并黏附宿主的纤维蛋白原，介导金黄色葡萄球菌黏附于生物体表面，并使细菌逃离免疫系统的识别，是生物膜形成的黏附阶段的重要调控蛋白。icaA 基因编码的蛋白是1 种普遍存在于金黄色葡萄球菌中的跨膜蛋白，具有N-乙酰葡萄糖氨基转移酶活性，与细菌生物膜的形成有直接关系，也是生物膜形成的必要因素。
在培养基中补充葡萄糖，可以促进细菌生物膜的形成，因此本研究采用含有葡萄糖的TSB 培养基培养MRSA（USA300），发现RIP1183 不影响MRSA（USA300）的生长，结果与文献报道的群体抑制剂不影响细菌生长的结论相一致。但是体外生物膜形成实验结果显示，RIP1183 可以显著抑制MRSA（USA300）生物膜的形成。为了探讨金黄色葡萄球菌不同生长时相agr 系统的激活情况，以及RIP1183对葡萄球菌溶素和生物膜形成的影响，分别在细菌迟缓期（2 h）、对数期（6 h）和稳定期（10 h），检测了RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 基因的转录水平。
结果显示，迟缓期（2 h）是细菌转接后对新环境的短暂适应过程，4 种基因RNAⅢ、HLA、icaA 和fnbA 总体表达水平都较低；进入对数期（6 h）后，细菌快速增殖，RNAⅢ表达水平快速升高，显示agr 系统被激活，HLA表达也快速增高；进入稳定期（10 h）后，HLA 表达下降，但是与生物膜形成的黏附相关基因（icaA 和fnbA）的表达水平升高。MRSA 通过agr 群体感应系统，在不同时相调控不同的毒力因子的表达，以适应不同生长环境。对数期，释放大量葡萄球菌溶素，增加细菌的毒力和致病性；到了稳定期，黏附相关蛋白表达水平增高，促进细菌生物膜的形成，有利于细菌对抗外界极端环境（如营养缺乏、低pH、高渗透压或抗生素等），这是细菌非常重要的环境适应机制。
更重要的是，在3 个时相，RIP1183 均能显著抑制RNAⅢ表达，同时显著降低对数期HLA 的表达及稳定期生物膜黏附相关基因（icaA 和fnbA）的表达水平。本研究结果提示，群体抑制剂RIP1183 能通过干扰细菌agr 系统，影响不同时相，不同基因的表达，从而破坏细菌对环境适应机制，可能是其抗MRSA 活性的重要机制之一。另外，群体感应系统抑制剂不影响细菌的生长，不会或几乎不会给细菌造成选择性生存压力，引起细菌耐药的可能性比较小[22]。因此，抑制群体感应系统可能成为治疗MRSA 生物膜相关感染性疾病的新策略。
RIP 衍生物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线及生物膜形成的影响（一）
RIP 衍生物对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌生长曲线及生物膜形成的影响（二）